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溃疡性结肠炎发病机制内外科治疗研究进展摘要：摘要：研究背景：溃疡性结肠癌人简称为U C同时也称其为非特异性结肠炎，就目前医学研究而言，溃疡性结肠癌炎的病因以及其相应的发病机制，并没有清晰的分析结果。并且溃疡性结肠癌的主要发病部位，在结肠或者职场的长黏膜和黏膜下层患有该病的患者，在临床表现多为腹痛，腹泻以及其他相应症状。目前，发现发病年龄主要为17-40岁。目前，该病的病因尚不清楚，因此对该病的发病机理的研究已成为临床和实验室研究的热点。同时，该病的病情被反复推迟，在临床中，可以发现溃疡性结肠癌眼有极大的癌变的可能性，并且患有该病的患者，大多数还伴有肠胃疾病此类疾病在临床上被定义为男治愈性疾病，并且已经在相关医疗平台中成为了讨论热点。在此背景下，作者总结了该病的发病机理和内外科医学治疗方案。目的：总结溃疡性结肠炎的发病机理及内外科治疗方法，为规范化内外科治疗溃疡性结肠炎提供参考。方法：以“溃疡性结肠炎的发病机理的内外科治疗”为主题，探讨溃疡性结肠炎的发病机理和内外科治疗方法，并总结其机理和治疗方案。结论：通过总结溃疡性结肠炎的发病机理和内外科治疗方法，可以得出结论，溃疡性结肠炎的发病机理关键是肠道粘膜免疫功能异常，其主要发病机制是肠黏膜屏障的破坏。目前，溃疡性结肠炎的内外科治疗方法包括传统药物，粪便菌群移植，高压氧治疗，中药中药治疗等多种治疗方法，但治疗的关键是全面，规范，个体化的治疗。 关键词：溃疡性结肠炎 发病机制 内外科治疗Abstract: BACKGROUND: ulcerative colitis (UC) is also called non-specific colitis. At present, the etiology and pathogenesis of the disease are not clear. The main site of the disease is rectum or colon. It mainly invades intestinal mucosa and submucosa. Patients may experience abdominal pain, diarrhea, mucosal lysis and other symptoms in the clinic. At present, the age of onset is mainly 17-40 years old. At present, the etiology of the disease is not clear, at the research of the pathogenesis for the disease have become at hot spot on clinical about laboratory research. At the same time, the condition of the disease was repeatedly delayed, and there was a possibility of canceration in clinical, with a variety of extraintestinal symptoms, so it was listed as a refractory disease in clinical, and its treatment was studied. The scheme have become at hot topic about clinical research. On this context, this author summarized about pathogenesis or treatment for the : To summarize the pathogenesis and treatment of ulcerative colitis, and to provide reference for standardized internal surgical treatment of ulcerative : to discuss the pathogenesis and treatment of ulcerative colitis, and summarize its mechanism and : by summing up the pathogenesis and treatment methods of ulcerative colitis, it can be concluded that the key to the pathogenesis of ulcerative colitis is the abnormal immune function of intestinal mucosa, and the main pathogenesis is the destruction of intestinal mucosa barrier. On present, on about treatment methods for ulcerative colitis at include traditional medicine, about fecal flora transplantate hyperbaric oxygen treat, traditional Chinese medicine or another treatment methods, in order to the key for the treatment at comprehensive, standardized or individualized treatment. Key words: pathogenesis treatment ulcerative colitis1.前言溃疡性结肠炎（UC）是一种非特异性炎症性疾病。目前，UC的发病机制尚不清楚。UC的炎症反应深度主要涉及结肠粘膜和粘膜下层。炎症反应部位主要从远端发展到近端，严重时甚至扩散到整个结肠。它的分布大部分是连续的。主要临床症状为腹泻，腹泻，粘液水肿，便血和腹痛。就目前的研究现状来看，溃疡性结肠癌人具有的发病机制研究分析上不清晰，但是UC的主要引起原因有遗传和环境，还有就是因为肠道璧的感染，之后，再引起肠道的菌群失调了免疫调节异常，其中长黏膜的免疫调节异常是引起该病发病的主要原因，结肠以及肠黏膜和下层是溃疡性结肠炎发病的主要环节之一，因为长黏膜对于结肠属于保护机制，具有免疫屏障的生理功能，这些屏障功能相互支持，以确保结肠粘膜功能的正常运行，从而不会损坏结肠。因此，肠粘膜的损害更可能导致肠感染并引起异常的免疫反应。同时，发现肠道微生态失调在溃疡性结肠炎的发病机理中起着重要作用。此外，一些研究发现溃疡性结肠也与精神因素密切相关。目前，2017年中国发表的关于治疗溃疡性结肠炎的炎症性肠病的共识性意见明确指出，溃疡性结肠炎的治疗应首先掌握分类，分期，分期治疗的原则。但是，随着溃疡性结肠炎发病机理研究的不断深入，目前的治疗方法已经多样化。同时，治疗方法的选择强调治疗方案的个性化和标准化。目前，溃疡性结肠炎的主要治疗方法有：传统药物治疗，粪便菌群移植，白细胞分离，高压氧治疗等。2.溃疡性结肠炎发病机制。目前，大量研究认为溃疡性结肠炎的发病机理可能如下：在环境因素的影响下以及肠道菌群或食物等抗原的参与下，遗传易感性启动了肠道免疫系统，导致肠道过度免疫。和肠道免疫反应的持续发展，最终导致肠黏膜屏障的破坏。粘膜损伤将不可避免地导致病原菌和毒素通过粘膜屏障穿透肠道；进入门静脉系统和淋巴系统以诱导免疫反应，并发展为溃疡性结肠炎等疾病。通过查阅大量文献，作者总结了由多种因素引起的免疫异常和肠粘膜屏障破坏的机制如下：1. 遗传因素现在关于溃疡性结肠炎的研究是遗传性的。例如，外国学者发现454名UC患者中有％有家族史。欧洲和北美的白人种族的发病率较高，而亚洲黄色人群的发病率相对较低。这表明UC的发生率与种族有关，UC主要由基因遗传。一些研究还发现miRNA（microRNA）在UC的发病机理中起着重要作用，因为发现它的基因可以影响肠上皮细胞的异常凋亡，破坏肠粘膜的完整性和肠屏障，并导致炎症反应加剧。2. 环境因素从目前研究结果来看，溃疡性结肠癌严的发病机制还有很大一部分原因是由于患者的饮食习惯以及生存环境。如果患者是因为其饮食习惯或者生存环境，致使长黏膜损坏则会诱发肠道的免疫性异常，该因素也会导致患者肠道内的菌群异常。目前，这些因素主要是饮食，抗生素和非甾体抗炎药的使用，压力和感染。如果有学者发现，大对于肉类蛋类以及蛋白质含量较多的食物，都会对于溃疡性结肠炎的发病风险，以及其手术的成功率有相对较高的影响，但是这一类因素对于结肠炎的影响并没有相关研究。从一般形式上来说，这些因素主要改变粘膜屏障的完整性，免疫应答的异常激活和肠道菌群失衡。肠粘膜屏障主要由基底膜，上皮细胞层和其表面上的粘液层组成。它具有防止细菌，抗原和其他有害物质进入肠道粘膜的功能，从而避免了先天性免疫细胞的异常免疫反应。按照具体功能分类及黏膜可以分为机械、化学、免疫、生物这四种屏障，并且如果患者自身的也是习惯或者生存环境，导致长黏膜以及黏膜下层上层损坏严重，则该患者的长黏膜屏障也会发生相应的变化，致使肠屏障受损。另外，免疫功能低下会导致肠源性感染，而肠源性感染会进一步导致免疫球蛋白含量降低，形成恶性循环。对于导致溃疡性结肠癌具体发生的主要原因是长黏膜的免疫异常，看黏膜异常的原因也主要是由于免疫细胞以及其分泌细胞因子。据信UC患者肠粘膜中抗炎细胞因子的水平降低，而促炎细胞因子的水平增加，导致免疫调节的不平衡。另外，UC的发病机制也与免疫细胞如树突状细胞有关，巨噬细胞功能障碍可能促进肠道炎症反应的发展。3. 微生物人的肠道中存在大量的共生菌群，主要包括优势菌群（如双歧杆菌，乳酸杆菌，肠杆菌，粪便细菌等）和条件性病原体（如肠杆菌，肠球菌）等。这些细菌构成了肠道微生态系统，具有非特异性防御和维持肠道生理功能的功能。目前，大多数学者认为肠道菌群失衡，与相关病原体的异常繁殖密不可分，致使肠道黏膜发生炎症反应，并且进一步引起了免疫异常，并最终发展为结肠炎。相关学者曾表明溃疡性结肠癌人的患者相比，正常人而言，其肠道的细菌卵形细菌有明显的增长趋势。4. 精神因素在临床上，一些溃疡性结肠炎患者有许多症状，主要包括紧张，焦虑，怀疑，出汗等症状。这些精神症状可能诱发或导致溃疡性结肠炎进一步加重。另外，一些学者发现IBD患者患有自主神经功能障碍，而精神因素可明显导致自主神经疾病。5. 感染因素对于肠道感染的分类大体可以分为两类，一是肠道菌群感染一是病毒性感染肠道菌群感染的发病机制，主要是由于芽孢杆菌以及幽门杆菌造成的，而病毒性感染则主要是由于疱疹病毒细小病毒等病毒引起的。目前，普遍认为感染在UC的发病机理中起一定作用，但是到目前为止，还没有分离出与UC密切相关的感染因子。已经发现梭状芽孢杆菌和拟杆菌属与UC患者的发病机理和病情加重密切相关，并且活跃患者的肠道中梭菌和细菌的含量显着增加。同时，在人体正常的肠道中存在着大量的细菌，其中肽聚糖核酸以及其衍生物是主要诱导溃疡性结肠癌严发病的一类细菌肽聚糖核酸及其衍生物是受体复合物主要活动与结肠上皮。近年来，研究（43-4）也显示UC与幽门螺杆菌，乙型肝炎病毒，巨细胞病毒等有关。3.溃疡性结肠内外科治疗进展根据上述文献，作者发现溃疡性结肠炎的发病机理不仅与遗传有关，而且在外界环境的诱导下引起肠道进行免疫调节以及紧缺失衡都会从一定程度上致使肠道黏膜不同程度的损害肠道中的微生物以及相关病毒也会影响长黏膜屏障的修复引起的异常，从而诱发溃疡性结肠癌以及其他相关性疾病。随着近些年来科学家对于溃疡性结肠癌的进一步治疗研究，包括药物治疗，粪便细菌移植，高压氧治疗，介入治疗，白细胞分离，干细胞治疗，中药治疗和外科手术。药物治疗由于UC的发病机制尚不清楚，因此药物治疗方案主要为5-氨基水杨酸类药物，糖皮质激素和免疫抑制剂，并根据病情补充其他药物。根据UC诊断和治疗指南，建议选择上述不同类型的药物，同时结合疾病的严重程度和疾病的范围，采用不同的给药方式。氨基水杨酸类药物1、柳氮磺吡啶柳氮磺吡啶（SASP）是UC的经典药物。其作用机理是抑制花生四烯酸的代谢，从而抑制下游炎症因子并起到消炎作用。其本身并没有治疗的相关效应，但其可以在患者肠道内分解为水杨酸和磺胺吡啶溃疡性结肠癌人具体的缓解效率，可以达到80%甚至更高S A S P的治疗方式，主要可以用于溃疡性结肠癌的轻度和重度。由于该药品相对廉价，但对于轻度和重度患者有明显的治疗效果，不该药品具有很大的缓解治疗优势，但在用于临床过程中也会存在患者出现不良反应的现象。（1）5-氨基水杨酸（5-ASA)特殊制剂美沙拉嗪（5-ASA）是一种柳氮磺吡啶（SASP），用于治疗溃疡性结肠炎。但是，由于大多数5-氨基水杨酸（5-ASA）被小肠吸收，因此常见的剂型会影响其功效。因此，为了达到更好的治疗效果并减少药物不良反应，在SASP的基础上开发了一种新的5-ASA制剂，主要包括：代表salofalk的缓释或控释剂型。口服后在回肠以下释放pH的环境中。奥沙拉嗪具有特殊的物理和化学特性，使其在胃和小肠中相对稳定，到达结肠后被结肠中的细菌分开，释放出5-ASA，从而在结肠中起到抗炎作用，从而降低了刺激胃和小肠，减少胃肠道的不良反应。美沙拉嗪以微粒和高浓度美沙拉嗪的形式存在，可以减缓药物释放，减少服药次数并提高患者的依从性。例如，谭跃发现，5-ASA口服制剂联合灌肠治疗具有多种病变的非严重UC疗效优于单独口服制剂。尽管5-ASA可以显着减少药物不良反应，但仍然偶尔出现不良反应，例如恶心，呕吐，肾脏损害，可逆的男性不育症，粒细胞减少，自身免疫性溶血，再生障碍性贫血，心肌炎等，因此血液常规，肝肾服用期间需要监测功能，心肌酶谱等。（2）糖皮质激素药物就目前的研究形势来看，对于溃疡性结肠癌的主要导致为糖皮质激素及可以抑制人体的免疫反应，致使抵抗力下降促进一些菌群的生长繁殖，进而导致溃疡性结肠癌人的发病，故在溃疡性结肠癌严治疗的过程中，对于糖皮质激素应该严格控制，但为了克服一些传统药物，对于患者产生的不良反应糖皮质激素的使用用量以及使用方向还有待进一步研究。一些学者发现倍氯米松二丙酸酯能有效治疗结肠炎，并且减少了不良反应。另外，由于糖皮质激素的副作用，因此不用于维持治疗溃疡性结肠炎。(3)免疫抑制剂目前，大量文献认为溃疡性结肠炎的主要机制是肠道免疫反应的过度持续发展，最终导致肠黏膜屏障的破坏。因此，它只能用于激素依赖性或无效的治疗，也可以用于激素诱导的缓解后的维持治疗。2015年，中华医学会消化系统疾病分会炎症性肠病小组的新共识提出，如果连续5天连续使用足够的静脉注射皮质类固醇而不起作用，则应考虑使用免疫抑制剂的组合，推荐药物为环孢霉素A（CS a）。由于环孢菌素A的作用很快，通常不到1周。但是，使用这种药物时应进而在一定周期范围内进行血常规的检测。除此之外，硫唑嘌呤也是治疗溃疡性机场严的免疫抑制药剂之一，但该嘌呤的作用周期较长，为12到16周顾期临床治疗意义不大，姜昆学者丁辉在A J A治疗中分析了溃疡性结肠癌炎的不良反应并且得出相关结论用硫唑嘌呤进行治疗后，患有风湿性关节炎的患者会加重其病情。因此，在临床和指南中不建议将硫唑嘌呤用于溃疡性结肠炎的诱导缓解治疗。(4)生物制剂发现TNF-α与UC有关。生物制剂通过抑制免疫应答途径中的关键因素发挥作用。目前，常见的生物试剂包括人抗TNF单克隆抗体，例如英夫利昔单抗，阿达木单抗和新的细胞因子抑制剂。英夫肟可以加速肠损伤的粘膜修复并减少激素剂量。例如，Xinghui等。用英夫西明治疗中，而中度的溃疡性结肠癌眼中的12周可以分为在第六周第22周以及第38周时的效率，分析，分别为60% 80%和90%相关学者刘静在英孚姓名治疗中进行研究对29力患有重度溃疡性结肠癌患者术后六周中的长黏膜恢复进行观测，并得出结论其复合率在48%。然而，英夫西林具有不良反应，如感染，自身免疫反应和局部反应，因此不建议常规临床使用。阿达木单抗具有与英夫西姆相同的治疗机制，但不良反应少，因此成为替代英夫西姆的主要药物。例如，周征用阿达木单抗治疗UC，与对照组相比，氨基酸水杨酸或激素治疗的有效率更高。当前，由于生物制剂的高价格和潜在风险，在中国生物制剂的临床使用较少。(5)微生态制剂根据目前研究可以发现溃疡性结肠癌人的发病机制有长黏膜屏障损害，并且其菌群混乱，通常在临床中可以发现益生菌益生元以及其衍生物由此可以看出益生菌的治疗，对于溃疡性结肠癌严的治疗至关重要。顾继伟等用双歧杆菌治疗120例UC患者，效果良好。我们可以预测，将来更适合中国人的微生态制剂将继续用于临床。粪菌移植疗法现在认为在人体肠道中存在大量微生物固定值，这些微生物固定值构成了肠粘膜的生物屏障。肠道菌群失衡主要表现为益生菌减少和病原微生物的繁殖。在这种情况下，作为一种能够维持肠道菌群结构的稳定性并恢复消化系统微生物环境的粪便移植疗法，已经成为该病治疗的热点。肠道中，并重建功能正常的肠道菌群，从而达到治疗肠道和肠外疾病的目的。粪便移植疗法可以追溯到东晋。FMT治疗UC患者始于1989年，治疗效果良好。此外，moayyedi等。对75例中度UC患者进行了粪便移植，发现实验组的临床缓解率为24％。因此，FMT对UC患者具有更好的疗效和安全性。尽管大多数文献报道粪便细菌移植对UC具有良好的作用，但是在FMT的临床应用中仍然有许多问题需要解决。例如，患者的心理接受程度，捐赠者的选择，最佳移植剂量，收集粪便的过程，最佳移植时间，时间和时期，粪便细菌的制备，最佳移植方式等。已经表明，通过结肠镜检查的FMT似乎比通过口服胶囊的FMT更有效。高压氧疗法高压氧疗法（HBO）是一种通过在高压环境中呼吸纯氧或高浓度氧气来治疗疾病的方法。高压氧治疗溃疡性结肠炎的主要机制如下：1.增加肠黏膜血管中的氧浓度，改善肠黏膜的供氧和代谢，有利于修复肠黏膜;2，干扰细菌繁殖，起到抗感染作用，防止进一步感染。此外，它可以抑制细胞免疫反应和粘膜炎症反应。因此，HBO治疗UC具有更好的疗效和安全性。造血干细胞治疗同时，具有再生能力的细胞为造血干细胞。溃疡性结肠癌人是一种可以自身免疫系统的疾病。主要原因是由于免疫耐受系统的紊乱。故从理论上来说，造血干细胞移植到患者的肠胃中，可以对于U C进行有效的治疗，除此之外还可以修复肠黏膜。在溃疡性结肠炎患者中，结肠粘膜干细胞的功能受到抑制，这会影响结肠粘膜的修复并导致炎症延迟。造血干细胞移植后，可以修复肠粘膜。因此，用于UC的干细胞疗法已显示出广阔的前景，但仍需要大量的样本才能进一步研究其有效性。介入治疗通过右股动脉穿刺插管，在治疗部位超选择给药导管，并注射抗炎药，免疫抑制药和营养药，达到治疗溃疡性结肠炎的目的。为内外科无效病例提供了一种新的治疗方法。中医中药治疗(1)中药药物治疗目前，溃疡性结肠炎的发病机理尚不清楚。尽管发病机理的研究取得了一些进展，并且西药的选择有所增加，但大部分都用于治疗溃疡性结肠炎，它有许多不良反应。同时，生物制剂的价格昂贵，并且粪便细菌移植的功效也有所报道。在这种情况下，使用中药治疗溃疡性结肠炎在溃疡性结肠中已取得一些进展和临床效果。根据临床症状的特点，溃疡性结肠炎一般属于中药痢疾的范畴。根据中医，该病的主要原因是外部致病因素的感觉和瘟疫，饮食不当引起的内伤，情绪和内伤以及脾，胃和肠的损伤。该疾病的主要病理因素是潮湿，其病理性质与缺乏，寒冷和高温不同。临床治疗应遵循以下原则：早痢，久痢，易涩，热痢，感冒痢疾和温痢，冷热混合，然后温热通畅；混合不足和过量，然后光滑而涩；再次在临床治疗原则的指导下，我们将思想分为治疗和分阶段治疗。根据分类和治疗，可将其分为六种证型：肠胃湿热，脾胃气虚，脾肾阳虚，肝郁脾虚，脾胃虚寒，活血化瘀和肠络，有六种代表性方药：牡丹汤，神灵白术散，理中四神丸，通邪药方和四逆散，四君子汤加诸车丸，少腹逐瘀汤。分阶段治疗可分为缓解期和活跃期。临床认为，活动期主要以致病固体为基础，治疗主要以消除致病因素为基础。代表性药方有少药汤，白头翁汤等，其缓解期主要以阳虚为主，主要治疗方法是加强右方，主要有神灵白术散，四神丸等。白头翁温汤对溃疡性结肠炎有很好的疗效，已成为研究热点。有学者发现白头翁汤能减轻炎症的阻断程度。同时，白头翁汤能上调黏膜阻滞中MUC2的表达，对黏膜屏障具有保护和修复作用。（2）中药灌肠疗法UC的主要病理变化是结肠黏膜溃疡和脓肿，而治愈UC的关键是修复溃疡。中医认为，肠道的病理变化为“ carb肿和脓肿”，属于“内肿”类别。根据各种疾病的起源理论。内unc综合症，内因疼痛是由于饮食不规律，不规则的冷热，内部和胸部，diaphragm肌，胃和肠的寒冷和寒冷，血液中的感冒，血气得以保留和停止，冷气互相梳理，停滞不散，热气繁殖，然后变成脓液，因此，对于溃疡性结肠癌严的有效治疗方法，还有中药灌肠。其治疗方法是直接针对病灶提高肠道内患病处药物的浓度，并且对于药物接触肠道的表面积与时长都进行了相对的增加，充分发挥中药药性，同时也避免了肠道吸收不良，对于中药灌肠的药效影响，在临床应用中无明显副作用。这拓宽了中医治疗的新途径，充分体现了中医治疗的优势和特点。一些研究表明，中药灌肠可以显着减少病灶粘膜的炎性分泌，改善局部血液循环，保留时间越长，药液的吸收越充分，恢复的速度就越快。这种疾病，预后越好。宋立勤等。用自制的灌肠剂对UC进行处理，煎出十多种中药服用液体灌肠剂，对于清热利湿有明显的效益。除此之外，保留灌肠相比较于口服硫磺必定相比，治疗优势较为明显相关学者习作，我先生则采用了保留灌肠，并结合不同的相关症状对重要的使用采取了不同的配方，最终并以西药治疗为对照组进行了研究发现中药灌肠有明显的作用，还证实了中药预处理可以减少粘膜损伤，改善临床症状并降低疾病活动指数。中药灌肠的临床应用简单，有效，值得推广。(3)中医其它治疗方法中医治疗疾病的方法很多，其中针灸，艾灸，按摩，中药外用，中药足疗最为常见。这些方法可用于加热经络，缓解疼痛并改善临床症状。(4)生活与心理调护目前，该病的发生与精神因素密切相关。同时，该病病程长，大多数患者神经，抑郁或焦虑，并具有严重的意识形态问题，因此对这种疾病进行心理护理非常重要。同时，疾病的发生与饮食密切相关，告知患者正确的饮食习惯已成为疾病治疗的一部分。例如，应提供柔软易消化的食物，并避免使用刺激性食物或牛奶，乳制品。4.总结根据对溃疡性结肠炎发病机理的上述研究，UC的主要发病机理总结如下：1.在环境因素的影响下，肠道菌群或食物等抗原参与了肠道免疫系统的激活。导致肠道免疫反应过度持续发展，最终会使得肠道黏膜屏障有所损坏，2、长黏膜屏障在受损后，其抵御能力大大降低免疫功能也会随之受到影响。3、肠粘膜屏障受到严重损害，使微生物菌群紊乱毒素会冲破屏障到达免疫或血管系统，最终使溃疡性结肠癌人发病。综合治疗，个体化治疗和中西医结合治疗可取得较好的疗效。
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38、上海市社区卫生服务中心检验开展现状及检验项目合理化设置研究
39、__医学检验集团发展战略研究
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【摘要】目的：研究讨论消化内科住院患者的院内感染的状况,分析患者的感染因素和感染特点,并提出一些控制的 措施 和 方法 ;方法：对2008年12月至2010年12月本院收治的消化内科院内感染患者总计40例的临床诊疗资料，施行回顾性剖析;结果：40例消化内科院内感染患者总共分离出60株病原菌,铜绿假单胞菌、大肠埃希菌等对常用抗生素的耐药性呈不断升涨发展方向;结论：要重视患者呼吸道的预防工作，同时还要正确使用抗菌药物,这将大大提高患者感染的恢复效果。
【关键词】消化内科;感染;患者;分析
为了了解消化内科住院患者的感染情况，分析了患者的感染因素和感染特点,并提出相关的控制措施和方法。特对本院2008年12月至2010年12月的消化内科住院40例病例采用回顾性的方法进行分析。
1临床资料
医院感染情况:消化内科住院患者发生医院感染40例(感染率，例次发生率)，其中男患者有24例(占了60%)，女患者有16例(占了40%)，60岁以上22例(占了55%);住院天数在一个月以下的有12例，一个月到两个月的有16例，两个月以上的有12例。
患者的感染部位:患者的感染部位在下呼吸道的有15例(占了)，在上呼吸道的有12例(占了30%)，胃肠道感染的有6例(占了15%)，泌尿道的有3例(占了)， 其它 4例(占了1%)。
分理出的病原菌:总共分离出60株病原菌(58%)。革兰阴性杆菌49株(占了)，其中的铜绿假单胞菌13株(占了)，肺炎克雷伯菌10株(占了)，大肠埃希菌7株(占了)，阴沟杆菌 6株(占了10%)，产气杆菌5株(占了)，鲍氏不动杆菌 8株(占了)。真菌11株(占了18?3%)，其中的白假丝酿母菌菌6株(占了10%)，白的颜色佛珠菌3株(占了5%)，其它真菌2株(占了)。
主要球菌耐药性:肺炎克雷伯菌对替卡西林耐药率无上，对亚胺培南的耐药率最低。
2讨论
本次调查表示，60岁以上22例(占了55%);住院天数在一个月以下的有12例，一个月到两个月的有16例，两个月以上的有12例，从这些数据可以得出年龄大和住院时间长是医院感染的易感因素。原发病第一诊断顺次为消化道恶心肿瘤、肝硬变、上消化道出血、胃和十二指肠溃疡、慢性胃炎、胰腺炎、慢性结肠炎，这些个恶疾(除胰腺炎)都归属慢性消耗性恶疾。恶性肿瘤因为肿瘤团体的浸润使患者抵抗力功能减退，各种放、化疗医治手段均可不同程度地使抵抗力功能减低;肝硬变患者肝网状内皮系统功能减低，胆道及胃十二指肠的机体机能功能发生障碍。 本调查，医院感染部位顺次为下呼吸道、呼吸道上、胃肠道、泌尿道，呼吸道感染最多见，与前人的研究基本上一致，而泌尿道感染比例低，有可能对小便监视检测不够相关。由于患者岁数偏大、病情较重，卧床时间相对较长，因为这个下呼吸感染几率便会相对增加，医疗事务担任职务的人早期不重视了扫除净尽口腔分泌物与异物，在往后的过程中虽再次注意到清除异物，也只能清除一部分的异物，而在早期已被吸入支气管儿的异物仍将会造成肺部感染，还由于消化系统的不舒服，易引流食品反流，及口鼻咽腔的分泌物、血液、吐呕物易误吸入肺。因为这个，尤其要重视呼吸道的预防控制工作，准确合理地使用抗菌药物。
本组病例感染常见病原菌以革兰阴性杆菌为主，其中以铜绿假单胞菌为首位，肺炎克雷伯菌第二位，与近年的研究结果完全一样。内在危险因素主要与医源性因素相关，与医疗处理办法的应用不科学或错误相关。铜绿假单胞菌耐药率对常用抗菌药物呈不断升涨发展方向，对亚胺培南的敏锐率达，对哌拉西林等最为耐药，其耐药率达，导致这种情况之一是滥用抗菌药物。大肠埃希菌耐药率较为敏锐的几种抗菌药物是亚胺培南、头孢吡肟、阿米卡星。鲍氏不动杆菌耐药率对亚胺培南的耐药率最低，为，其次为阿米卡星、头孢噻肟、头孢他啶和头孢吡肟，作别为，，和，其它抗菌药物也有不一样程度的耐药率，且多重耐药率高，导致医治上的艰难，所以一旦发现被感染，应该尽快采取控制措施，防止引起医院感染的突发流行。
真菌感染多为老年患者，与老年个体圣体虚弱、营养不好、抵抗力功能衰落以及广泛预防性运用或多种联合使用抗生素相关。到现在为止，真菌耐药情况固然不是十分严重，不过在医治上颇为棘手，由于真菌感染的患者一般病情严重、复杂，死亡人数的比率较高，且抗真菌药物可选择的范围不大。
参考文献
[1]苏智军，张奕返.肝病患者医院感染的前瞻性研讨. 中华医院感染学杂志，2000，10(5)：321～323
[2]叶惠芬，刘平，陈惠珍，等.广州地区肺炎克雷伯菌散布和耐药性调查.实用医学杂志,2006,22(7):833～835
[3]李萍，卢仙成，邓济苏，等.重症监护室取得性感染与广泛散布机制研讨.中华医院感染学杂志，2000，10(6)：404～406
[关键词] 消化内科学;双语教学
双语教学的英文是“Bilingual”，即“Two languages”，是指在课堂上利用两种语言进行教学的方法，是 教育 国际化发展的大趋势，是高等教育改革的一项重要举措[1]。我院近年来在大学本科七年制教学中开展了消化内科学的双语教学，取得了良好的教学效果。现将在教学过程中的应用体会和问题 总结 如下，并提出相应的优化教学措施。
1 消化内科课程双语教学的应用体会
注重教学互动性
双语教学应强调师生间的互动，主张教学环境、教学资源等全方位的第二语言的交互，只有当外语在 医学知识 教学过程中得到运用，当外语和母语两种不同的语言能在学生的思维与交流中自由切换的时候，我们才可以认为"双语教学"获得了成功。在课程采取双语教学前与广大同学进行充分的交流，得到一定的反馈信息，相应选择一个合适的中英文使用比例，做到因材施教。授课时要注意课间随时注意学生的反应，询问学生对本部分讲解是否能较好理解，以便了解学生的吸收程度，并及时调整上课的语速。让学生及时对难懂或不懂之处提问，以决定是否复述重点内容，必要时重点或难点内容可用中文重复讲解，但母语的使用要控制在最低限度。
注意因材施教
在消化内科课程双语教学中，结合本校的教学目标和学生外语实际水平，按照先进性、学术性、易接受性的原则，形成自编外语教材，并提前2周发给学生预习。将预习教材中涉及的较难的医学词汇单独标识出来，并加以中文释义，以便学生预习，提前扩大学生医学外语词汇量，这样才能避免讲课时学生如一头雾水。根据学生对课堂教学的反应，动态调整双语教学所使用的中英文比例，这样便于对课堂上新内容的理解和吸收，大大地提高教学效率。
强调教学手段多样性
在实际应用中，我们注意做到以下几点：①选择适宜的课件：采用的课件既有自行制作的多媒体课件，也借鉴或直接选用国外已经出版的英语医学教学课件。②选择合适的电子词典：目前广泛应用的"全医药学大词典"(目前流行使用的版本至少有四种)，由于收集的医学词汇全面， 且绝大多数词汇配有发音，是医学双语教学非常有用的工具。③利用多样化的教学手段：如图片、多媒体、录像等，尽量把医学中的抽象概念具体化、直观化，以帮助学生更好地理解医学专业知识。④辅助 网络技术 [2]：我们教学过程中利用我校自己的局域网，通过FTP或文件共享等方式做到多媒体课件上网，方便学生随时查询，递交作业;另外开设教学论坛，方便学生提出问题和解决问题。
2消化内科课程双语教学存在的问题
师生双方的素质影响了双语教学的推广
教师是实施双语教学的主体，教师水平高低是影响双语教学效果的首推因素，教师水平高低决定了"传道、授业、解惑"中有效信息量提供的数量与质量[3]。目前我校执教的大多数教师没有受过正规的双语教学培训，教师多数只具备教授某一学科的执教能力，应用外语讲授专业知识的能力相对欠缺，水平也不高。同时，尽管七年制学生的整体英语水平较高，但也存在水平参差不齐的现象。因此，教师本身的开课能力和学生的外语基础影响了双语教学的实际效果。
缺乏优秀的双语教学教材
双语教学原则上应使用外文原版的教材，没有原版教材，双语教学犹如无源之水，无本之木。然而，目前国际上通用的教材价格昂贵，一般院校很难承受高额的教材费用，故引进原汁原味的外文教材难度较大。因此，不同教师使用的教材有的是国外原版教材，有的是节选外文教材，也有的是教师自编的讲义，版本和内容不统一，教学随意性较大。另外，教材难易程度的不同也影响了双语教学的实际效果。
双语教学是我国高等教育与国际接轨、迎接新世纪挑战、培养具有国际竞争力人才的必然要求，也是当前教学改革的重点和 热点 。尽管双语教学已取得了初步成效，但其探索工作仍将是大量的、复杂的和艰巨的，只有通过深入地学习思考，认真分析研究，理清思路，才能将双语教学更有效地进行下去。
[参考文献]
[1] 鲁建云，王 斌，黄进华，等.双语教学面临的困难与对策[J].实用预防医学，2004，11(4):839-840.
[2] 李 蕾，陆 柳，邢 萱，等. 多媒体与网络技术挑战现代教学模式[J]. 继续医学教育，2003，17(4):46-48.
[3] 罗育林，张阳德. 医学双语教学模式的探讨[J].中国现代医学杂志，2003，13(13)：147-149.
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因为正常人体是在肠道有一些益生菌在防止这些正常的菌群，可以擦灭一些入侵的病菌，维持肠道的健康状态。所以平时要尽量饮食合理，避免挑食，也不要长期吃冷饮，要以一餐餐规律正常，这样才能更好的保护肠胃。
人体的肠道健康是维持免疫系统的成熟，胃肠运动性和身体健康至关重要。从我们的出生，肠道中有害细菌，肠道病原细菌和益生菌开始在没有烟雾的情况下战斗。有一个着名的学者认为“这个人的生物不是母亲不是助产士或医生，而是细菌”。
婴儿和幼儿参考0-3岁的儿童，在这个阶段，如果肠道菌群建立延迟或异常，肠道相关淋巴组织发育和成熟，肠道阻隔能力细胞增加不良反应；婴儿和幼儿的正常肠菌株为持久的健康肠道奠定了良好的基础。因此，婴儿和幼儿肠道菌群的平衡是肠道健康的关键因素。
自然分娩：自然分娩可以促进婴儿正常肠道菌群的建立。自然分娩不是无菌过程中，在双歧杆菌和乳酸杆菌的诞生中开始种植，经过几个小时后，外部环境中的细菌在肠内迅速种植给宝宝。WSORAGE婴儿发生了食物过敏和呼吸道感染的风险。母乳喂养：雄性牛奶含有200多种类型的人乳寡糖，可促进肠道益生菌性质，母乳中的双歧杆菌和乳酸乳酸乳酸乳酸乳酸乳酸乳酸乳酸率超过90％的细菌总数的90％以上，这些益生菌的pH值可以减少粪便，从而抑制致病细菌的种植园。
适当的补充益生菌：经验丰富的宝马将使用益生菌产品来帮助维持宝宝的肠道植物平衡，如何选择益生菌产品？国际益生菌和益生菌科学联合会规定，“在可控制条件下，在可控条件下必须存活，对目标人口有验证的健康效果，并且有明确的微生物单体或混合，安全”，如妈妈，如妈妈，使用芽孢杆菌和雄性细菌，耐高温性，持久的活性，发挥作用。简而言之，孩子是增长最快的两个年龄，并且有大量的营养支持，因此良好的消化吸收能力至关重要，而肠道菌群平衡是肠道健康的关键因素，如果婴儿期间是建立良好的肠道健康可以大大提高身体的免疫力，降低传染病的风险。
:肠道菌群与儿童的免疫系统有非常密切的关系。对于正常人来说，预防肠道菌群失调，在饮食上需注意，在日常生活中应多吃一些有益肠道健康的食物。一是富含膳食纤维的食物，除了红豆、绿豆等粗杂粮外，木耳、海带、裙带菜、口蘑等菌藻类食物同样含有丰富的膳食纤维，利于有益菌生长
修改:相关网站:我给你提供一些大肠杆菌的资料,比较乱,自己去整理.三凉食品这个术语没有听说过,如果可以解释一下,或许我会知道.大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展 大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观一、细菌培养与鉴定 1．分离培养早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。培养基：山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）添加了头孢克肟和鼠李糖（)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清—山梨醇发酵培养基 增菌液：含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟 亚碲酸钾 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L2．免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（）84份中有23份（）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份()仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 3．生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）与O157有鉴别意义的生化反应见表1。MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 二．血清学检测1．玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA 4．免疫荧光技术5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法1．玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。4．免疫荧光技术 DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 固相荧光毛细管免疫分析此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。5．胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析(IEHA)该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。7. 全自动抗原抗体检测系统VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 8.免疫印记法目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。特点是具有比较高的特异性和敏感性 。免疫检测 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；2) 用毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；4) 用毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次； 5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。 1．DNA探针探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素()等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。2. PCR技术 聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。PCR技术扩增体系的基本成分引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度 。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。 4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度 mmol/L。 PCR技术循环参数PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。循环参数1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。循环参数2．引物退火 引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。 循环参数3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 循环参数扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp94℃变性时间（秒） 30 30 60 6055℃复性时间（秒） 30 30 60 6072℃延伸时间（秒） 30 38 120 180一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。PCR扩增产物的检测方法PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。PCR技术类型 免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术 复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术 锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术 多重PCR技术 巢式或套式PCR技术PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR:kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。23SrRNA基因特征：原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。应用：检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。 大肠杆菌O157: H7的检验程序 样品 增菌6小时 磁珠浓缩 可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂G染色 生化反应 血清学 毒力基因 大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据 有下列情况之一具有实验室确诊意义： 1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．小结自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。 第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基 (三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。一、大肠茵群检验(一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时
大肠埃希菌201株耐药性分析胆盐抑制冷冻保存大肠杆菌生长的研究分子生物学中常用的大肠杆菌菌株大肠杆菌高效表达重组蛋白策略
学术堂整理了十个关于大肠杆菌的论文题目,供大家参考:1、大肠杆菌表达系统的研究进展2、重组大肠杆菌高密度发酵研究进展3、山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定4、大肠杆菌mtID基因和gutD基因的克隆,全序列测定和高效表达5、我国部分地区禽病原性大肠杆菌的分离与鉴定6、中国不同地区家禽大肠杆菌血清型分布和耐药性比较研究7、大肠杆菌毒力因子研究概况8、致病性大肠杆菌的耐药性监测9、动物大肠杆菌耐药性的变化趋势10、纳米银对大肠杆菌的抗菌作用及其机制
0引言脆性X综合征（fragile X syndrome, FXS）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1（fragile X mental retardation, FMR1）中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致. FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生［1-2］. 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究.1材料和方法材料大肠杆菌DH5α, BL21（ DE3）和表达载体pRSET A均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自Sigma公司； 限制性内切酶BamH I和KpnI购自宝生物工程公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司； Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司. 方法 表达载体的构建根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物：CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA，CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG. 其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列. 设计PCR扩增体系25 μL，灭菌去离子水10 μL，10×反应缓冲液 μL，25 mmol/L MgCl2 μL，DMSO μL，4× dNTP混合物（每种 mmol/L）2 μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol，模板 μL（50 ng/μL）， Taq DNA（5 μ/μL）聚合酶 μL. 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min. PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因. 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A，酶切产物电泳后回收，在T4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落.融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转入BL21（ DE3）. 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中， 37℃振荡培养12 h， 按10 mL/L比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，32℃诱导振荡培养4 h，离心收集菌体，SDSPAGE分析重组蛋白的表达.蛋白表达形式的分析取5 mL菌液离心，用500 μL的裂解液（10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH ）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行SDSPAGE分析.融合蛋白的纯化将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱. 过柱结束后，用4 mL漂洗液（20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH ），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用 mL洗脱液(250 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH ) 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集. 取收集液，进行SDSPAGE分析.与（CGG）29重复序列双链DNA结合实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/L TrisHCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 g/L Tween 20）15 μL重悬磁珠，各5 μL分3组实验. 其中一组加入25 μL（100 ng/μL）生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA，另外两组分别加入25 μL（100 ng/μL）非生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL，25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后，弃上清. 重复上述步骤3次；加入纯化后CGGBP1（500 μg/mL）15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl， mmol/L DTT，100 g/L甘油）20 μL，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μL，沸水煮10 min，进行SDSPAGE分析.2结果原核表达载体的构建及鉴定扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504 bp的条带（图1）； 重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A分别用BamHI和KpnI酶切，pRSET A/CGGBP1分为两个片段，分别为 ku和504 bp（图2），均与预计结果相同.的表达用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒，筛选阳性重组质粒. 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的 BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导后，在Mr 约25 000处出现1条表达条带；而未经IPTG诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分. 经SDSPAGE分析表明，CGGBP1部分存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3）. 蛋白纯化在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游， 插入有连续6个组氨酸的序列 —(His )6 tag. 重组质粒经诱导表达后，(His )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. SDSPAGE显示，CGGBP1得到较高程度的纯化（图4）.与5′d（CGG）293′重复序列双链DNA结合实验生物素化的5′d（CGG）29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（CGG）293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理，加入CGGBP1后，未和5′d (CGG）293′重复序列双链DNA结合的蛋白也被洗脱（图5）.3讨论关于微卫星的产生机制，普遍认为是DNA复制过程中DNA聚合酶的滑动［4］，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列，通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体RNA基因中非常复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程. 脆性X综合征是Igarashi等［7］研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和（CGG）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］. 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义. 本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒，以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过Ni2+NTA柱纯化，获得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.
修改:相关网站:我给你提供一些大肠杆菌的资料,比较乱,自己去整理.三凉食品这个术语没有听说过,如果可以解释一下,或许我会知道.大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展 大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观一、细菌培养与鉴定 1．分离培养早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。培养基：山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）添加了头孢克肟和鼠李糖（)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清—山梨醇发酵培养基 增菌液：含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟 亚碲酸钾 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L2．免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（）84份中有23份（）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份()仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 3．生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）与O157有鉴别意义的生化反应见表1。MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 二．血清学检测1．玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA 4．免疫荧光技术5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法1．玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。4．免疫荧光技术 DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 固相荧光毛细管免疫分析此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。5．胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析(IEHA)该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。7. 全自动抗原抗体检测系统VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 8.免疫印记法目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。特点是具有比较高的特异性和敏感性 。免疫检测 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；2) 用毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；4) 用毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次； 5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。 1．DNA探针探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素()等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。2. PCR技术 聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。PCR技术扩增体系的基本成分引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度 。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。 4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度 mmol/L。 PCR技术循环参数PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。循环参数1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。循环参数2．引物退火 引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。 循环参数3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 循环参数扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp94℃变性时间（秒） 30 30 60 6055℃复性时间（秒） 30 30 60 6072℃延伸时间（秒） 30 38 120 180一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。PCR扩增产物的检测方法PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。PCR技术类型 免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术 复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术 锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术 多重PCR技术 巢式或套式PCR技术PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR:kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。23SrRNA基因特征：原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。应用：检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。 大肠杆菌O157: H7的检验程序 样品 增菌6小时 磁珠浓缩 可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂G染色 生化反应 血清学 毒力基因 大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据 有下列情况之一具有实验室确诊意义： 1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．小结自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。 第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基 (三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。一、大肠茵群检验(一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时
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游泳池的水干不干净检查方法：1、用眼看，如果直接能看出来水很脏，那就不要去洗了。2、用手摸，凭感觉，如果感觉水质很“滑”，那么肯定不干净。3、测试，用消过毒的玻璃杯取游泳池的水20毫升，放入水螅五只，认真观察其生活状况，作好记录，如果一星期后水螅死亡，则水很干净，否则很脏。
CODNOX杂质颗粒度PH值如果是饮用水 还要做 大肠杆菌 以及微生物菌群培养实验
粪大肠菌群 粪大肠菌群是大肠菌群的一种，又名耐热大肠菌群 粪大肠菌群是生长于人和温血动物肠道中的一组肠道细菌,随粪便排出体外,约占粪便干重的1/3以上,故称为粪大肠菌群。受粪便污染的水、食品、化妆品和土壤等物质均含有大量的这类菌群。若检出粪大肠菌群即表明已被粪便污染。大肠菌群 1、大肠菌群是指一群好氧及兼性厌氧,在37℃、24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌,它主要来源于人畜粪便,通常可作为水体粪便污染的指标菌大肠菌群 2、大肠菌群是指37℃生长时能发酵乳糖,在24h内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌,除包括大肠埃希氏杆菌属外,还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸椽酸菌属、克雷伯菌属 3、大肠菌群是指一群能在36℃,24h内发酵乳糖产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌.它主要包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌、枸椽酸杆菌、克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌 文献来源 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。粪大肠菌群和饮用水 国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。 青岛第一海水浴场粪大肠菌群超标 青岛第一海水浴场粪大肠菌群超标环保总局公布了上周全国16个沿海城市28个海水浴场的水质报告。报告显示，青岛的第一海水浴场因粪大肠菌群超过2000个/升，水质差，不适宜游泳。 粪大肠菌群检测方法 粪大肠菌为总大肠菌群的一个亚种；直接来自粪便，除了它耐热，在44-44．5℃的高温条件下仍可生长繁殖并将色氨酸代谢成吲哚，其他特性均与总大肠菌群相同。 总大肠菌群中的细菌除生活在肠道中外，在自然环境中的水与土壤中也经常存在，但此等在自然环境中生活的大肠菌群培养的最合适温度为25℃左右，如在37℃培养则仍可生长，但如将培养温度再升高至44．5℃，则不再生长，而直接来自粪便的大肠菌群细菌，习惯于37℃左右生长，如将培养温度升高至44．5℃仍可继续生长。因此，可用提高培养温度方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分。在37℃培养生长的大肠菌群，包括在粪便内生长的大肠菌群称为“总大肠菌群”(Total coliform)；在44．5℃仍能生长的大肠菌群，称为“粪大肠菌群”(Fecal coliform)，粪大肠菌群细菌在卫生学上具有重要的意义。 1．5检验注意事项 (1)将接种好的样品放人恒温水浴箱或隔水式恒温培养箱时，箱内温度一定要求达到所要求的温度(44±1℃)时，方可放入。如用恒温水浴箱其水面要高于接种物面，放滤膜的培养皿要沉到水浴箱底部。 (2)MFC培养基中苯胺蓝的纯度和质量往往影响菌落的颜色，根据试验结果用进口苯胺蓝加O．1g，用国产苯胺蓝加0．2g，培养出的粪大肠菌菌落颜色较典型。但国产苯胺蓝的性能是否同样稳定尚不能肯定。因此，制好的培养基在使用前，最好先接种典型粪大肠菌，以观察对比菌落的颜色。 玫红酸高压后会分解，配好的试液应在2-lO℃保存不超过2周，如颜色由暗红变成棕色沉淀时应弃去。如杂菌污染少，且加与不加玫红酸对菌落计数无影响时，可不加。． (3)在滤膜上生长的菌落除挑取蓝色菌落外，浅蓝色菌落或浅蓝色中心较深的菌落也应挑取。 (4)生活饮用水通常都是经氯处理消毒的，水中含有一定量的余氯，使大肠菌群处于受损或受抑制状态，在采集水样时应加硫代硫酸钠脱氯，使此受损的细菌得以复苏与修复，从而避免计数结果偏低甚至假阴性出现。 (5)采样后水样的正确保存很重要，如保存不当可使检样中的大肠菌群细菌死亡或在一定条件下再生长，这些都将影响检验结果的准确性。检验室接到水样后，应立即检验。如因故不能检验时，应立即置于冰箱内并于2小时内检验。 关于水样储存时间与温度对大肠菌群数的影响，Lonsans等报告认为水样中大肠菌群数不多时，则冰箱保存与室温保存相差不大；如水样中菌数多时，则在室温(23-39．5℃)内保存比在冰箱(0-1O℃)中保存菌数的减少速度快。 水质粪大肠菌群检测仪器 JMS2009型大肠菌群在线快速监测仪,可以对大肠杆菌,总大肠菌群,粪大肠菌群,总粪大肠杆菌等多种生活中常见菌类进行快速检测. 仪器特点 自动检测 操作简便，不需要复杂、昂贵的实验室器材和专业人员即可现测试 自动取样频率可编程设定：从每小时一次～每24小时一次 检测周期短，小于12小时（分析速度快） 可高通量连续检测 真正做到实时、在线、自动检测 多种输出功能 粪大肠菌群检测仪 测量原理 FC培养液是最适宜大肠菌群和粪大菌群生长的 微生物培养基，大肠菌群和粪大肠菌群含有一种特异 性酶，本系统采用的底物可被这种特异性酶分解释放 出一种化合物，使培养基的颜色发生变化。本系统通 过检测培养基的颜色变化，检测水体中的大肠菌群及 粪大肠菌群。FC培养液是专利产品。 应用范围 适用于饮用水、地表水、地下水及污水等大肠菌群、 粪大肠菌群的自动监测。 样品分析方法 将水样注入FC培养液，在一定温度下进行细菌培养 （大肠菌群需恒温°C，粪大肠菌需恒温°C）。通 过连续光度测量，检测水样中的大肠菌群和粪大肠菌群。 每个样品测量结束后，仪器自动对管路进行灭菌处理。 技术参数 采样体积： 检出限：1个/100ml 采样频率：1小时（可调） 测量周期：最长12小时 检测时间：少于12小时 培养温度：°C或°C 管路消毒：每次测量前，污染后 管路清洗：每次管路消毒后 试剂：培养液：1瓶/样品 次氯酸钠（有效氯：）：5L星期 零点校正：每次进样前自动校正 参比溶液：培养液 通讯接口：RS232或485 报警信号：控制器故障、温度故障、微处理 故障、仪器故障 远程控制：远程控制启动和待机 环境：防潮、防尘、温度0～40°C 电源：220VAC/50HZ 防护等级：IP55 外型尺寸： 重量：100kg
其实按照相关水的环境质量标准进行监测项目选定就可以了，比如地表水监测内容可以是pH、CODCr、高锰酸盐指数、BOD5、氨氮、砷、氟化物、挥发酚、阴离子表面活性剂、总氮、总磷、粪大肠菌群、铅、镉、汞、锌、铜、石油类、硫化物、六价铬、氰化物等；地下水可以是PH、总硬度、溶解性总固体、高锰酸盐指数、氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氟化物、氯化物、硫酸盐、阴离子表面活性剂、氰化物、挥发酚、六价铬、铜、铅、锌、铁、锰、镉、总汞、总砷、硒、总大肠菌群、细菌总数及矿化度等。
最新有标准的：CJ/T-2018 城镇污水水质标准检测方法 中有新增酶底物法检测粪大肠菌群