细胞毒性实验与毕业论文

细胞数量确定1.将细胞悬浮液（100μL/孔）接种在96洞孔板中。将板在潮湿的培养箱中预孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。2.向板的每个孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰.读数。3.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。4.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。细胞增殖和细胞毒性测定1.将种子细胞以103-104个细胞/孔的密度在96孔板中在100μL培养基中培养。将细胞在CO2培养箱中于37℃培养24小时。2.将不同浓度的待测物质加入板中。3.将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如，6,12,24或48小时）。4.使用重复移液器向板的每个孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰.读数。5.将培养板在培养箱中孵育1-4小时。6.在读取孔板之前，重要的是在轨道振动器上轻轻混合1分钟，以确保颜色均匀分布。7.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。数据分析统计分析有几种方法，您可以选择使用.值或细胞数量，我们提供其中一种方法。细胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100As =实验孔吸光度（含有细胞，培养基，CCK-8和待测化合物的孔的吸光度）。Ab =空白孔吸光度（含有培养基和CCK-8的孔的吸光度）。Ac =对照孔吸光度（含有细胞，培养基和CCK-8的孔的吸光度）。制作标准曲线1. 细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数。2. 使用培养基，等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要5-7个浓度梯度，每组几个复孔。然后接种细胞。（注意每孔的细胞数量。如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。）3. 培养直至细胞贴壁（通常2-4小时），然后每100 μl培养基加入10 μl CCK-8。继续孵育1-4小时，用酶标仪测量450nm处的吸光度。制作出一条以细胞数为X轴坐标，.值为Y轴坐标的标准曲线。可以基于该曲线确定待测样品的细胞数。使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件相同。注意事项1. 确保药物和CCK8均匀分布在培养基中。2. 细胞增殖越多, 颜色越深; 细胞毒性越强，颜色越浅。3. 对于贴壁细胞，每孔至少需要1000个细胞（100 μl培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要2500个细胞（100 μl培养基）。推荐的96孔板每孔最大细胞数为25000。如果使用24孔或6孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整CCK-8的体积，使其为每孔总液体体积的10％。4. 因为CCK8测定是基于活细胞中的脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能导致实际活细胞数与使用CCK-8测定活细胞数之间有差异。5. WST-8可能与还原剂反应生成WST-8 formazan。如果使用还原剂 (例如一些抗氧化剂)会干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。6. 孵育2小时后，背景.值一般为单位。7. 注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰.值。8. 如果您想对CCK8溶液进行灭菌，请使用 μm的膜过滤溶液。9. 孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（长达4小时）或大量细胞（~105细胞/孔）。10. 如果细胞悬液中存在高浊度, 测量并减去样品在600nm或更高波长的值。11. CCK8不能用于细胞染色。12. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。13. CCK8的毒性非常低，在CCK8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐。）14. 该试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。15. 在读取平板之前，您可以在摇床上轻柔混匀。16. 我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发，可以用PBS，水或培养基填充这些孔。17. 如果您没有450nm滤光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之间的滤光片, 450nm滤光片具有最佳灵敏度。18. 测量450nm处的吸光度，如果您需要进行双波长测定，作为参考波长可以测定650nm处的吸光度。19. 药物中金属离子的存在可能会影响CCK8的灵敏度。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、 90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。Glpbio是新启的世界领先的高性能的生命科学产品供应商之一，产品涵盖癌症、神经科学、抗感染、表观遗传学等20个热门研究领域，覆盖Akt、Jak等近千个细分靶点。上海宏叶生物科技有限公司是GlpBio在中国区的总代理。推荐测试剂 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

细胞毒性可以会导致细胞死亡，细胞其他的不良反应，这样实验将不能进行。在实验中，一般都有规定细胞毒性不高于某个数，这是基本的检测。

细胞毒性是化学物质（药物）作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱，所引发的不良反应。按作用机制可分3种类型：①基本细胞毒性，涉及一种或多种上述结构或功能的改变，作用于所有类型的细胞；②选择细胞毒性，存在于某些分化细胞上，主要通过化学物质的生物转化，与特殊受体结合或特殊的摄入机制所引发；③细胞特殊功能毒性，对细胞结构和功能损伤轻微，但对整个机体损伤非常严重。类似毒性作用可通过细胞因子、激素和递质的合成、释放、结合和降解影响细胞与细胞间的交流或特殊的转运过程而实现。毒性作用也可能来自化学物质对细胞外过程的干扰，任何一种非动物检测系统对多种因素都应加以考虑。1983年Ekwall提出“基本细胞功能”的概念，即多数化学物质毒性作用是对细胞功能的非特异性损伤，却可引起器官功能的特异性改变甚至机体死亡。有研究显示化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间都存在良好的相关性。化学物质产生的损伤和死亡，最终可表现为细胞水平上的改变，由此推测体外细胞毒性可以预测体内急性毒性。从早期研究至今已有50多年，可预测体内急性毒性的体外系统得到发展。体外细胞毒性和急性毒性之间的定量研究主要是对RC（Registry of Cytotoxicity）数据库（美国国立职业安全与卫生研究所化学物质毒性作用数据库）中多种化学物质的体外细胞毒性IC50值及体内急性毒性LD50值进行相关分析，获得RC预测模型，用于急性毒性LD50值预测。利用细胞毒理学比较多种检测终点、不同组织和种属的预测能力，发现啮齿动物细胞系对啮齿动物急性毒性，人源细胞系对人体急性毒性均有良好的预测能力。BALB/c3T3细胞和人正常角质细胞（NHK）在验证实验中具有良好的稳定性及预测能力，因此推荐作为细胞毒性分析常用细胞系，其它细胞系及检测终点也可使用。体外方法有助于预测化学物质急性暴露引发的全身和局部影响，并评估体内毒性浓度。因此进行急性毒性检测前首先进行体外细胞毒性分析，然后根据RC预测模型进行LD50值预测，选择体内急性毒性最适宜的开始剂量，减少实验动物的使用。

可以通过细胞毒实验的数据评估药物的有效性、毒性、耐药性、药物对细胞凋亡、增殖等作用的影响。药物对细胞的所有作用，最后综合的表现为细胞毒效果，其实也就是看加药后细胞的死活，这个实验是非常有意义的，在研究药物确切的机理前 ，在预实验中先做下细胞毒实验可以事半功倍