流式巨噬细胞毕业论文

流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力巨噬细胞是固有免疫系统的重要成员， 具有吞噬、 清除及呈递抗原异物的生物学功能， 是维持机体的正常生理状态所必需的 。传统的显微镜镜检记数法检测巨噬细胞吞噬能力存在主观性强、 重复性差及耗时长等缺点， 影响实验结果的客观性与准确性。流式细胞仪技术用于巨噬细胞的吞噬率检测可以轻易地将观察细胞数从几百上升至几千， 而且具有分析速度快、 重复性好和特异性强等优点。荧光微球被细胞吞噬后， 其荧光信号可迅速被流式细胞仪检测， 具有荧光信号的巨噬细胞即视为出现吞噬现象， 可 快速、 准 确地测 定 巨噬细胞 的吞 噬率 。《 保健食品检验与评价技术规范增强免疫力功能评价方法( 征求意见稿) 》 中要求用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球试验替代巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验》， 本研究的主要 目的是在征求意见稿的基础上， 摸索最佳实验条件， 从而使该方法能灵敏稳定的反映小鼠腹腔单核一 巨噬细胞吞噬能力。 本文利用流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球能力试验方法的灵敏性、 稳定性以及易操作性，结果发现：小鼠腹腔巨噬细胞浓度调整为1*10E5~2*10E5/ml，孵育1h，1 × 10E7／孔微球浓度可使实验快速而又精确地反映巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数。

巨噬细胞的功能

巨噬细胞（Macrophage, M）是一类位于外周血，炎症组织中的白细胞。在动物体内主要通过吞噬细菌，死亡细胞及细胞残片等作用参与非特异性免疫调节（先天性免疫）而随后将吞噬的物质消化并将其特征递呈倒后续淋巴细胞及其他免疫细胞参与特异性免疫调节（后天性免疫）。

巨噬细胞隶属于免疫细胞中单核细胞类群，其主要来源为造血干细胞。造血干细胞能够分化为髓样干细胞及淋巴样干细胞两个类群，髓样干细胞后续主要分化为单核细胞，红细胞及血小板等细胞类群而淋巴样干细胞后期主要分化为T，B及NK细胞等。巨噬细胞主要由造血干细胞，单核细胞（Monocyte，注意与单个核细胞mononuclear cell是不一样的，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞），巨噬细胞分化顺序分化而来。

图1 免疫细胞分化类群

巨噬细胞首先在骨髓中发育形成单核细胞，巨噬细胞进入血液后以单核细胞的前体形式存在。当单核细胞浸润在组织及器官之中后，最后分化完全，成为巨噬细胞。巨噬细胞主要存在于淋巴结，肺泡壁，骨髓，肝脏以及脾脏等器官。

巨噬细胞根据功能及炎症因子分泌水平分为M1型巨噬细胞及M2型巨噬细胞两种亚群。M1巨噬细胞（经典激活巨噬细胞），主要由LPS及IFNγ激活，分泌高水平的IL2及较低水平的IL10，主要起到促进炎症发生发展，杀菌及吞噬等作用。而M2巨噬细胞（交替激活巨噬细胞）主要由IL4炎症因子激活，主要通过分泌IL10等抗炎细胞因子抑制M1巨噬细胞，在伤口愈合及组织修复等进程中起作用。

图2 M1/M2细胞分化示意

在临床研究中，研究人员主要通过M1，M2巨噬细胞表面marker及炎症因子表达水平进行M1，M2类群分析。如利用F4/80，CD80，CD206流式抗体通过流式细胞仪分析细胞亚群中M1，M2细胞比例。也可以通过qPCR，ELISA等研究方法研究IL10，TNFα等炎症因子表达水平分析M1，M2细胞类群分类比例。具体marker选择可以参考相关网站： 。

、巨噬细胞亚型在炎症疾病中研究

M1型巨噬细胞在体内主要起到吞噬细菌等外来物质及凋亡细胞碎片等内源性物质，起到保护组织器官免受外来物质侵袭。在炎症性疾病中，M1型巨噬细胞在早期炎症部位富集，并被LPS，TNFα，IFNγ等促炎因子激活，并随后通过分泌IL12等炎症因子的方式促进炎症的发生发展，保护机体免受外来物质侵袭。而在炎症后期，M2细胞则起到了抑制炎症，修复组织，及组织结构重建等作用。在炎症发生发展M1/M2巨噬细胞类群数目比例随着时间的推移不断变化，最终完全消除炎症的影响。而在某些慢性炎症及特定急性验证进程中，M1/M2细胞类群比例失调，过度M1细胞类群激活会导致组织严重损伤，并导致后续更严重的炎症因子风暴等不良症状。

因此，在炎症疾病治疗中可以通过抑制M1细胞类群数目，提高M2细胞类型比例的方式对炎症开展治疗。

、巨噬细胞亚型在肿瘤疾病中研究

肿瘤相关巨噬细胞（tumor associate macrophage，TAM）指被募集到肿瘤微环境中的巨噬细胞。早期研究认为巨噬细胞具有抑制肿瘤的作用，但是后续研究发现TAM能够通过抑制免疫反应，促进血管生成，刺激肿瘤细胞浸润及转移等机制促进肿瘤恶化。

图3 TAM在肿瘤发生发展中作用

TAM作为肿瘤微环境中重要的细胞组成部分，在肿瘤微环境组成及功能构成方面起到了重要的作用。肿瘤微环境中TAM细胞多数表现出M2型巨噬细胞特征，高表达IL10，起到抑制肿瘤微环境免疫反应的作用。而后续肿瘤微环境的研究也证明M1/M2比例失调是肿瘤发生发展，免疫逃逸以及后续转移耐药等疾病进程中起到关键作用。因此以巨噬细胞极化为治疗靶点的抗肿瘤药物开发及治疗也是当前治疗的重点。

巨噬细胞是先天免疫系统的重要成分，以高度异质性和可塑性为特征。研究不同亚型巨噬细胞在不同疾病及肿瘤中的功能能够通过调控免疫系统活性的方式调控疾病发病进程起到事半功倍的作用。因此，掌握巨噬细胞相关背景知识也是研究人员必备技能储备。