中国免疫学杂志甄自力

苦参提取物目前国内外研究最多是苦参碱,下面这篇文章你看一下有帮助吗?苦参碱抗肿瘤作用及其机制的初步研究中华首席医学网 2007年11月01日 22:35:18 Thursday 点击次数：22 作者：马玲娣 张彦 文世宏 何於娟 刘小珊 康格非 蒋纪恺 作者单位：南京医科大学附属常州第二人民医院中心实验室，常州 213003 《中国免疫学杂志》2007年5月23卷5期 中医中药与免疫 加入收藏夹 【摘要】 目的：研究中药苦参碱（Matrine）的抗肿瘤作用及其免疫学机制。方法：MTT比色法检测肿瘤细胞的生长抑制率；流式细胞术分析细胞周期的改变。建立荷瘤小鼠模型，观察小鼠肿瘤的生长情况,计算肿瘤生长抑制率；MTT法测定苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖作用的影响；ELISA法检测苦参碱治疗后小鼠血清中IL�2和IL�12的活性。结果：苦参碱可显著抑制小鼠肿瘤细胞的体外分裂和增殖，且抑制作用呈浓度和时间依赖性，使G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，细胞增殖指数降低。苦参碱对小鼠实体瘤生长具有显著抑制作用，抑瘤率高达以上；明显抑制小鼠静止PBMC的体外增殖作用；不能提高荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12的含量。结论：苦参碱具有较强的抗肿瘤作用，体内体外却表现出一定的免疫抑制作用，提高机体的免疫功能不是苦参碱发挥抗癌活性的主要机制。 【关键词】 苦参碱；肿瘤；免疫调节 Preliminary studies on anti�tumor activies of matrine and its immunological mechanism MA Ling�Di, ZHANG Yan, WEN Shi�Hong, HE Yu�Juan, LIU Xiao�Shan, KANG Ge�Fei, JIANG Ji�Kai. The Central Laboratory, the Second Changzhou Hospital, Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Changzhou 213003, China 〔Abstract〕 Objective:To explore the inhibitory effects of matrine on tumor growth and the possible mechanisms related to immunological tumor cell growth repression rate was measured by MTT colorimetry. Flow cytometry was used to analyze the cell cycle of H22 cells. The H22 BALB/c xenograft tumor models were established. The anti�tumor effect of matrine was observed and tumor growth inhibitory rate(IR) was calculated. The effect of matrine on the proliferation of peripheral blood mononuclear cell(PBMC) separated from H22 tumor�bearing BALB/c was determined by MTT assay in vitro; the content of serum IL�2 and IL�12 were examined by ELISA inhibited proliferation of the H22 tumor cells in both time and concentration�dependent manners, with increased the cell numbers at G1 phase and decreased numbers at S and G/M phase showing the possible mechanism for lowering cell proliferation rate. The tumor inhibition rate of matrien came up to in tumor�bearing mice. Matrine significantly suppressed the proliferative activity of PBMC from tumor�bearing mice. Furthermore, martine could not increase the contents of murine serum IL�2 and IL� could inhibit tumor cell growth directly but not exert the anti�tumor efficiency through reinforcing the immune function. 〔Key words〕Matrine；Tumor；Immunoloregulation 苦参碱是我国传统中药苦参中提取出的一种主要的活性成分，具有消炎抗菌、抗过敏、抗心率失常等多种药理学作用〔1，2〕。我们多年来的研究表明，苦参碱在体外可诱导人白血病细胞K562向正常形态分化，有效抑制K562细胞的体外增殖〔3，4〕。随着对苦参碱提纯和药效作用的深入研究，发现苦参碱还具有抗肿瘤作用，但目前对苦参碱抗肿瘤尤其是抗实体瘤方面的研究还不够深入，其体内外的抗肿瘤机制仍不明了，尤其是与荷瘤机体免疫功能之间的关系还是未知。为了认识苦参碱抗癌作用的机理和特点，我们选用小鼠H22肝癌细胞为研究对象，建立荷H22肝癌移植瘤小鼠模型，观察了苦参碱对H22细胞的抑制作用和其对荷瘤小鼠免疫功能的影响，以期探讨苦参碱抑瘤作用与机体免疫功能之间的关系。 1 材料与方法 材料 苦参碱购自陕西省科学院西安植物园植物化学开发研究所，纯度为；RPMI1640培养基Gibco公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；刀豆蛋白A(Con A)及MTT〔3�(4,5)�双甲基�2�噻唑�(2,5)�二甲基溴化四氢唑盐〕均为美国Sigma公司产品；小鼠淋巴细胞分离液：天津灏阳生物制品科技有限责任公司出品；IL�2和IL�12 ELISA kit购自广州晶美生物过程有限公司；环磷酰胺（CTX）为上海华联制药有限公司产品，200 mg/支，批号000211；H22腹水型小鼠肝癌细胞由重庆医科大学基础医学院病理生理教研室惠赠；SPF级BALB/c小鼠，重庆医科大学实验动物中心提供；96孔细胞培养板：丹麦Duke公司；CO2培养箱：德国Heraeus公司；光学显微镜：日本Olympus；酶联免疫吸附检测仪美国Bio�Rad MODEL550型；电子数显游标卡尺：广州一途电子有限公司YT�203型。 方法 苦参碱对H22细胞生长的影响 收集对数生长期H22细胞，调整浓度为5×104 ml-1，接种于96孔细胞培养板中，每孔200 μl，实验分为实验对照组（只加试剂）和阴性细胞对照组（只加RPMI1640培养液）。实验组中加入终浓度分别为、、、和 mg/ml的苦参碱。每种浓度均设8个平行孔。培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中常规培养44小时后，离心弃上清，各孔均加入RPMI1640 200 μl，5 mg/ml MTT溶液20 μl，继续培养4小时，离心弃上清，加入二甲基亚砜200 μl，振荡器上振荡5分钟溶解蓝色结晶，混匀后以酶标仪于570 nm处读取各孔吸光度值（A570），计算肿瘤细胞的生长抑制率。 细胞生长抑制率(%)=1-实验组A570均值对照组A570均值×100%。 苦参碱对H22细胞周期的影响 取对数生长期H22细胞，调整浓度为3×105 ml-1/20 ml，接种于100 ml细胞培养瓶中，加入苦参碱，使其终浓度分别为、和 mg/ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养48小时后收获细胞，PBS洗涤2次，70%冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶（PI）室温染色30分钟后，经流式细胞仪检测细胞周期时相分布，计算细胞增殖指数（PI）。 PI(%)=S+G2/MG1+S+G2/M×100%。 荷H22肝癌移植瘤小鼠模型的建立 对数生长期H22细胞，以RPMI1640调整细胞浓度为5×106 ml-1，于BALB/c小鼠左侧下腹部行无菌皮下接种，接种量为 ml细胞悬液，细胞总数为1×106个。接种24小时后称重分组，将BALB/c小鼠随机分为4组：苦参碱高浓度组（Mhigh）和低浓度组（Mlow），给药量分别为50 mg/kg体重和100 mg/kg体重；阳性对照组给予20 mg/kg体重的CTX；阴性对照组（ control）给予等量无菌生理盐水。每组小鼠20只，每日以腹腔注射（）方式给药， ml/只，隔日1次，连续注射7天。 苦参碱对H22荷瘤小鼠移植瘤生长情况的影响 停药后次日处死小鼠，剥出瘤体称重，计算肿瘤生长抑制率(IR)。 抑瘤率（%）=对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重对照组平均瘤重×100%。 苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖反应的影响 小鼠外周血单个核细胞(PBMC)的分离〔5〕 BALB/c小鼠颈椎脱臼致死，无菌取脾，盛有无菌Hanks液的平皿中轻轻捻碎脾组织，以250目不锈钢筛网过滤，收集得到脾细胞悬液。用小鼠淋巴细胞分离液按常规方法操作，分离得到小鼠PBMC悬液。台盼蓝染色计数活细胞数95%以上，以含10%胎牛血清的RPMI1640配成1×106 ml-1细胞悬液。 苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖反应的影响〔6〕 试验组为含有5 μg/ml ConA的小鼠PMBC悬液，内加入不同浓度的苦参碱溶液，使其终浓度分别为100、200和500 μg/ml。阳性对照组仅含5 μg/ml ConA，空白对照组为加入等体积PBS溶液。将上述细胞悬液分别加入到96孔细胞培养板中，每孔200 μl，试验组和对照组均设6个复孔(n=6)。加好样品的96孔培养板置于37℃、5%CO2的孵箱中培养72小时, MTT法步骤同前述。根据以下公式计算刺激指数(SI)： SI(%)=实验孔A570均值对照孔A570均值×100%。 苦参碱对荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12水平的影响〔7〕 各组小鼠停药后次日摘眼球放血，静置后离心(3 000 r/min，10分钟)分离血清。ELISA法检测荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12的活性。 统计学处理 实验数据以x±s表示，多组间差异性比较采用方差分析（one way ANOVA），使用SPSS 统计学软件进行分析。 2 结果 苦参碱对H22细胞生长的抑制作用 mg/ml苦参碱作用于H22细胞48小时后，细胞生长被抑制2%左右，、、和 mg/ml苦参碱均可显著抑制H22细胞的增殖，生长抑制率分别为15%、54%、86%和92%，且抑制作用呈剂量�效应依赖性，见表1，提示苦参碱可直接杀伤体外培养的H22细胞，具有较强的细胞毒作用。表1 苦参碱对H22细胞的增殖抑制作用（略） 苦参碱对H22细胞细胞周期的影响 、和 mg/ml苦参碱作用48小时后G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，作用具有明显的剂量依赖性，见表2，显示苦参碱可有效抑制细胞周期的正常转换，使细胞在G1期堆积，细胞阻滞于G2/M期，从而阻止细胞的有丝分裂，使细胞增殖受到抑制。表2 不同浓度苦参碱对H22细胞周期的影响（略） 苦参碱对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用 苦参碱处理组小鼠的瘤体体积分别为（±）mm3和（±）mm3，明显小于对照组小鼠瘤体体积（±）mm3，成瘤时间也明显晚于对照组；50 mg/kg和100 mg/kg剂量苦参碱的抑瘤率分别为和，明显高于对照组（P<），抑瘤效果接近CTX；高浓度组与低浓度组的抑瘤效果接近，无明显量效差异(P>)，见图1。 苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖反应的抑制作用 苦参碱单独作用时，明显抑制小鼠静止PBMC的体外增殖，SI小于PBS对照组（P<），对ConA活化了的小鼠PBMC增殖表现出一定的协同刺激作用，但刺激作用随苦参碱浓度的增高而降低，见表3。表3 苦参碱对小鼠PBMC体外增殖活性的影响（略） 苦参碱对荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12水平的影响 苦参碱治疗后，血清中IL�2和IL�12的水平没有明显改变（P>），提示苦参碱不能促进荷瘤小鼠合成和分泌IL�2和IL�12，见表4。表4 苦参碱对荷瘤小鼠IL�2和IL�12水平的影响（略） 3 讨论 本研究中，我们通过体内外实验观察了苦参碱对小鼠H22肝癌细胞的作用，发现苦参碱作用后H22细胞分裂相减少，胞内颗粒明显增多，大量空泡出现，显示出较强的细胞毒性。苦参碱对H22细胞的增殖抑制作用具有时间和浓度的依赖性，低浓度苦参碱对H22细胞的抑制作用不明显，而 mg/ml及更高浓度的苦参碱则可使细胞数量明显减少，增殖受到明显抑制。此外，苦参碱可使G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，细胞阻滞于G1→S期；细胞增殖指数降低，与细胞增殖抑制试验的结果相一致，表明苦参碱可以影响肿瘤细胞内DNA的复制和合成，抑制细胞的正常分裂；抑制细胞进入S期，从而使细胞在G1期堆积，出现G2/M阻滞，从而抑制细胞的增殖〔8〕。 苦参碱对小鼠H22实体瘤的生长也有明显的抑制作用，抑瘤率达60%以上。实验过程中发现，给以苦参碱治疗的部分小鼠给药后15天始终未形成明显的肿瘤结节，仅在接种处的皮肤表面出现紫红色溃疡性结痂，另有部分小鼠实验初期出现了肉眼可见的皮下肿块，但随着治疗的进行，肿块逐渐缩小至不见；苦参碱治疗后的小鼠，皮下瘤块的出现时间也普遍晚于对照组1～2天, 肿瘤生长速度也明显减慢，表明苦参碱能显著抑制小鼠肿瘤的发生和发展。由于实验中采用的是经腹腔注射的全身给药方式，可以排除苦参碱局部用药产生的毒性作用，表明苦参碱的抑瘤作用是通过机体自身的抗肿瘤机制起作用。 本研究发现，苦参碱不管是对荷瘤小鼠静止PBMC以及ConA活化了的PBMC的体外增殖反应都具有一定的抑制作用，显示了苦参碱在抗肿瘤同时，对免疫功能有一些抑制作用〔9，10〕。抗肿瘤免疫应答反应中，IL�2和IL�12是调节机体细胞免疫功能的两种重要的细胞因子，但本研究结果显示，苦参碱作用前后，小鼠血清中IL�2和IL�12的水平无明显改变，提示苦参碱对小鼠的抗肿瘤细胞免疫应答反应没有明显促进作用〔11〕。 以上研究结果表明，苦参碱对肿瘤所致的小鼠免疫功能低下状态没有明显改善，体内体外实验中都显示出了一定的免疫抑制效应，其抗肿瘤作用主要不是通过提高机体的免疫功能来实现的，还存在有其他的作用机制。【参考文献】 1 肖培根. 新编中药志 〔M〕. 北京：化学工业出版社, 2002：555�561. 2 刘 梅，刘雪英，程建峰.苦参碱的药理研究进展 〔J〕. 中国中药杂志，2003;28（9）：801�804. 3 Zhang Y，Jiang J K，Liu X S et al. Differentiation and apoptosis in K562 erythroleukemia cells induced by matrine 〔J〕.Natural Medicine，1998;52(4):295�298. 4 Zhang L P，Jiang J K，Tam J W et al. Effects of matrine on proliferation and differentiation in K562 cells 〔J〕. Leuk Res，2001;25(9)：793�800. 5 沈关心，周汝麟. 现代免疫学实验技术 〔M〕. 武汉：湖北科学技术出版社, 2002:396�398. 6 杨 镇. 肿瘤免疫学 〔M〕. 武汉：湖北科学技术出版社, 1998:31�64. 7 金伯泉.细胞和分子免疫学 〔M〕.第2版.北京：科学出版社，2001：475�479. 8 司维柯，尚桃元，康格非. 苦参碱对人肝癌细胞HepG2的细胞形态学影响和相关增殖因素的变化 〔J〕.第三军医大学学报，2000;22(6)：553�556. 9 毛慧生, 刘洪隐, 李 川 et al. 苦参碱对肿瘤细胞恶性表型及免疫功能的调控作用 〔J〕. 中国肿瘤临床, 1996; 23(11): 799�803. 10 冯亚珍，周 蓉，李秀枝 et al. 苦参碱调节免疫功能的实验临床研究进展 〔J〕. 中华实验和临床病毒学杂志，1996;16(5)：308�310. 11 曹雪涛. 白细胞介素2的基础与临床 〔M〕. 北京：北京科学技术出版社, 1990：80�98.

问问免疫学在现代的实际应用是什么？最佳答案免疫学的实际应用人工免疫和生物制品 免疫学作为研究手段 与免疫系统有关的疾病 人工免疫和生物制品种牛痘预防天花是人类学会应用免疫方法预防疾病的第一个先例，至今已有200多年历史。这个方法很有效 ，所以一度危害很大的病毒感染疾病天花在人类社会几近绝迹。近代，已能大规模工业化生产用于人工免疫的各种制品，统称生物制品。生物制品大量用于传染性疾病的预防，治疗和诊断。1）人工自动免疫生物制品生物制品本身是抗原成分，注射抗原成份，使人体产生相应抗体，因而对相应的病毒或细菌有了抵抗能力。传统的抗原成份有两类：（1）活疫苗——预防结核病的卡介苗是活的结核杆菌，但经过处理，变成弱毒或无毒，注射时仍应当控制剂量。常用的脊髓灰质炎疫苗，麻痹疫苗均为活疫苗。（2）死疫苗——百日咳疫苗，伤寒疫苗等均为死菌体注射，安全性强。但需多次接种。后来又发展起类毒素，亚单位疫苗等新品种。近年来，基因工程疫苗逐渐走上应用。在找到病原微生物表面抗原蛋白的基础上，可以用基因工程方法，把一种甚至几种表面抗原蛋白的基因克隆出来，大量表达生产，收到安全性好，效价高，多重抗性等效果。例如，把流感病毒血凝素基因加上单纯疱疹病毒基因，组合到牛痘苗基因组中去，制得可用针刺法接种的多价疫苗。2）人工被动免疫生物制品生物制品本身是抗体（或含抗体的抗血清）成份，注射抗体成份，使人体被动地获得对相应病原菌或毒素蛋白的抵抗能力。其中专一性较强的是各种抗血清。如抗狂犬病毒血清，抗乙脑病毒血清，抗破伤风毒素抗血清。而免疫球蛋白制品专一性不强。如：胎盘球蛋白或血浆 r —球蛋白的注射，实际上是使人体增加非专一性的抗体成分。免疫学作为研究手段由于抗体—抗原结合的专一性，人们在研究中常常制备针对所研究的蛋白质的抗体，用于目的蛋白质的检测和分离等方面。有时，也可以制备针对一段较小肽链或糖链的抗体，但是，制备时要加上佐剂以增强免疫效应；或把较小肽链连接到一个大的蛋白质分子上去，以增强免疫原性，这个较小肽链就称为半抗原。酶联免疫吸附法（简称ELISA）是常用的测定微量蛋白质的免疫方法，专一性强，灵敏度高，可检测出少至10-9克蛋白质。单克隆抗体技术面对愈益提高的对抗体的需求——数量要多，质量要高，传统方法暴露出固有的不足：一方面，这套操作程序太繁琐，一只只动物进行免疫，抽血，难以大批量生产；另一方面，所得到的抗血清，往往是多克隆的，即不但有针对目的抗原的抗体，也有针对非目的抗原的抗体，就针对目的抗原的抗体来讲，一个大的蛋白质常常有若干个抗原决定簇 ，所得到的抗体也是针对各个抗原决定簇混杂着的。单克隆抗体技术的问世解决了上述两个难点。用目的抗原（例如抗原A）免疫过的小鼠，脾脏中贮存有大量 B 细胞，这些 B 细胞能分泌针对抗原 A 的抗体，但是这些成熟了的 B 细胞不能再分裂繁殖。淋巴瘤细胞具有无限繁殖的能力，但是它们不能产生专一于 A 抗原的抗体。两种细胞融合，产生出的杂交瘤细胞，具有双方的长处，既能分泌专一于抗原 A 的抗体，又能无限增殖。与免疫系统有关的疾病1）过敏与移植排斥这两种情况，严格来讲是免疫系统的正常反应。有的人对花粉过敏，每到花粉季节，就发生哮喘，有的人对一些蛋白质过敏，吃后身上发出“风疹块”，有的人对蜜蜂蜂毒过敏，遭蜜蜂螫后可引起休克。这些情况都是起源于外源物（花粉，蛋白质等）激活 B 细胞，B 细胞产生的抗体作用于肥大细胞，使肥大细胞分泌过量的神经递质—组胺。许多过敏反应是短期内身体某部分组胺过多引起的。所以许多脱敏药物都和对抗组胺的效应有关。皮肤，器官和肢体移植通常会引起人体的免疫排斥反应，应该说这是正常的身体对外来物的排斥和攻击反应。为了移植成功，就需要使用免疫抑制药物，把正常的免疫反应抑制下去，给移植物以存活的机会。2）自身免疫疾病按照克隆选择学说，人体的免疫活性细胞在发育的过程中，那些针对自身蛋白质的淋巴细胞克隆就被消除了。所以，成熟的 B 细胞不会分泌针对自身蛋白质的抗体，成熟的 T 细胞也不会攻击自身正常的细胞。由于某种特殊情况的出现，免疫活性细胞错误地向自身的组织和器官发起攻击，这就是自身免疫疾病。常见的自身免疫疾病有：风湿性关节炎，红斑狼疮 ，风湿热等。一部分糖尿病人，也是因为自身免疫系统错误地攻击破坏胰岛细胞，使胰岛素不能正常分泌所致。目前，对自身免疫疾病的理解还很肤浅，发病机理并没有真正弄清楚，治疗也不甚得力。3）免疫功能低下症免疫功能低下或缺失，可以来自几个方面原因，其结果是使患者抵抗力减弱，易受感染。有的孩子生下来就患有严重综合型免疫缺失症（SCID）。因为缺失一个编码腺嘌呤脱氨酶（ADA）的基因，B 细胞和 T 细胞都不能正常发育成熟，这样的孩子生下来就得放在无菌隔离（参见第六讲）。1990 年进行了一次针对 SCID 病儿的基因治疗，从患儿的骨髓中抽出骨髓细胞， 用基因工程手段，以逆转录病毒为载体把 ADA 基因，送入骨髓细胞，ADA 基因整合到细胞染色体中去 ，骨髓细胞发育成正常的淋巴细胞。再注射回患儿的骨髓中去。治疗收到良好效果，4 岁的患儿有了正常的淋巴细胞，具备正常抵抗力，可以走出隔离室，和别的孩子一起上幼儿园（参见第六讲有关图片）。免疫功能低下也可能由肿瘤引起。癌细胞在发展中，常常分泌一些抑制免疫的成分，所以癌症病人通常表现免疫功能低下。手术切除除了避免扩散外，也起到清除抑制免疫的根源的作用。通常手术切除以后，加用一些激活和提高免疫功能的药物。术后进行的化疗，对骨髓细胞有较强破坏力。所以，化疗也会引起免疫功能低下，更有必要同时使用提高免疫功能的药物。值得一提的是，情绪会影响免疫功能。乐观向上的积极的精神状态，有助于免疫功能正常发挥，而情绪压抑悲伤会促使免疫功能低下。这正反映了大脑中枢对全身机能的调节作用。4）爱滋病爱滋病是获得性免疫缺失综合症（AIDS）的简称。一般认为，爱滋病的起因，来自一种人免疫缺失病毒（HIV）对 T 细胞的侵入。HIV 病毒侵入 T 细胞后，还能结合在寄主细胞染色体上，不断增殖。其后果是使病人失去免疫能力。爱滋病是一种性传播疾病。对爱滋病和 HIV 病毒的研究，在世界范围内引起极大重视。查看全文2017-01-16 10其他1条回答高中生物细胞学说内容这么学习_别等高中之后后悔!高中生物细胞学说内容孩子成绩差,下滑?思路单一?_补救方法大全!知晓这些方法,成绩提高到600分,你也可以轻松逆袭,广告怕老就来细胞剥离_专注再生美学_掌握剥离核心技术细胞剥离细胞剥离逆龄抗衰,帮你夺回人生中美好的时光,再生美,掌握核心技术水剥离,个性定制,自然和谐,安全无痕. 拨打:客服在线免费答疑广告免疫学在现代的实际应用是什么?优质推荐查询免疫学在现代的实际应用是什么？，我们为您推荐更多优质商家，资质保证，放心选择有保障！商家列表广告免疫治疗免疫系统免疫诊断免疫学免疫学与临床有何关系各种免疫学方法免疫系统的功能有三种免疫的概念免疫功能紊乱怎么引起的免疫系统的三大功能免疫学论文自身免疫病例子免疫中国免疫学杂志免疫学杂志免疫学的应用上滑了解更多 ￥2FT0bmb5p6d￥

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γδT细胞的抗原识别机制中国免疫学杂志 1999年第10期第15卷 述评作者：何维单位：中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院免疫室，北京 100005 T细胞表面表达两类抗原受体（TCR）：TCRαβ和TCRγδ。TCRαβ可特异地识别由抗原呈递细胞（APC）表面Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子呈递的抗原肽，而TCRγδ则主要以MHC非限制方式识别各类抗原。最近对TCRγδ所识别的抗原类型及方式进行了较为深入的研究，本文就其进展作一述评。 1 TCRγδ的多样性和分布特点提示其抗原识别的特殊性 同TCRαβ和免疫球蛋白(Ig)类似,TCRγδ基因由重组的V、D、J和C区组成。虽然γ、δ位点的V区多样性不及α和β,但其连接区多样性则使TCRγδ存在甚至超过TCRαβ多样性的潜能〔1〕。然而,许多γδT细胞亚群仅取用了其受体库中很有限的一部分,一些特定的Vγ、Vδ和连接区序列的组合导致TCRγδ结构单调化〔1〕。小鼠γδT细胞有3种发育途径：第一组在胎儿胸腺中发育,分批产生的γδT细胞分别进入特定的上皮组织。这些细胞重组单一的γ/δ基因,并具有单一的连接区序列,表现出单一的特异性。Vδ5细胞进入皮肤,Vδ6细胞进入生殖道上皮和舌；第二组在成年胸腺中发育，大多表达Vγ1或Vγ4或少量Vγ2或Vγ7,并具有广泛的连接区多态性,其库容较大，主要分布在外周血中,偶尔也进入粘膜组织；第三组的发育是非胸腺依赖性的，主要为Vγ7和Vγ1,有较大的连接区多态性,主要分布在小肠上皮。因此,γδT细胞的抗原特异性覆盖了从单一特异性到极端可变的范围〔2〕。γδT细胞在不同分布部位的预先设定提示它们可能是识别特定抗原的特殊T细胞群体，而并非象TCRαβ细胞分布一样具有随机性。在人类中,Vδ仅取用δ链中的一种。成人外周血中大于70%的Vδ表达Vδ2,其余为Vδ1。Vδ2与VR9共表达,而Vδ1与Vγ中某一种共表达〔3〕。 2 γδT细胞的抗原识别类型与机制 MHC分子 一些文献报道小鼠和人γδT细胞可识别MHC Ⅰ和Ⅱ类分子。人类外周血γδT细胞(Vδ9)可识别同种异体树突状细胞(DC)/单核细胞表面的MHCⅡ类分子〔4〕。 1987年Matis 等利用同种异体APC在体外刺激无胸腺小鼠的脾细胞建立了一些MHC限制性的γδT细胞系〔5〕。它们识别同种异体细胞上非己的MHC分子并呈现特异性反应，但其特异性不同于传统的αβT细胞。例如,γδT细胞系LBK5可识别MHCⅡ类分子I-E的多个等位基因产物〔6〕。IEK是小鼠Ⅱ类MHC分子，可结合各种肽段和超抗原，刺激αβT细胞活化。Schild 等发现LBK5对IEK识别时,结合于IEK的肽段并不传递特异性，同时经典的抗原处理也未启动〔7〕。各种细胞对LBK5刺激能力的不同都可归结为其表面MHC分子表达的情况，而与细胞来源、类型和影响MHC-肽段装载的因素无关。结合在平皿上的IEK蛋白对LBK5的刺激与表达IEK的细胞引起的刺激强度相仿，这些结果表明LBK5是直接识别IEK分子的。 也有大量报道γδT细胞可识别非经典的MHC类分子。从裸鼠Balb/c脾脏中分离出G8系可识别T10和T22抗原〔6，7〕。Porcelli 等从免疫缺陷病人身上分离出CD1c限制性的γδT细胞。 Schild 等对G8系作了深入研究，发现T10和T22有94％的同源性〔7〕。与LBK5相似，G8克隆对T10/T22的识别不经传统的抗原处理途径。同样，不同细胞对激活γδT细胞的能力也都归于其表面MHC表达的情况，Ⅰ/Ⅱ类抗原处理过程对其并无影响。如小鼠细胞系RMA-S和人细胞系T2在将肽类负载于MHC I类分子上都有缺陷,而转染了T22的RMA-S和T2都可激活G8细胞。非常有意思的是，G8可识别果蝇（Drosophila melanogaster）细胞上表达的T10/T22，而果蝇并不具有与哺乳类相似的免疫系统，也缺乏任何抗原处理-呈递所必需的因子。上述结果表明，这些所谓的MHC限制性的γδT细胞克隆对经典MHC的识别似乎并不通过抗原的处理和呈递。MHC分子作为抗原本身被识别，而这些细胞上负载的肽段也都并不起配基的作用。另有报道，γδ细胞克隆可识别一种单纯疱疹T型跨膜糖蛋白gI〔8〕。在抗原处理缺陷的RMA-S细胞上表达的完整的野生型 gI可被细胞所识别，同样，包被与平皿上的可溶性重组gI-Ig也可被识别，这表明gI是不通过抗原处理和其它分子的呈递而被直接完整识别的。γδT细胞对蛋白抗原的识别似更倾向于直接识别而不经过处理和呈递。特定的MHC分子恰好是作为抗原而非抗原呈递分子被识别的。 非MHC分子 显而易见，相对于TCRγδ庞大的序列多态性，其经典抗原识别的种类还是太少。大量文献显示TCRγδ具有与TCRαβ截然不同的抗原识别途径。目前有两类分子被证明是TCRγδ配体：含磷酸基的非肽类小分子和热休克蛋白。 磷酸化基团 人类主要的γδT细胞亚群Vγ9/δ2可在分枝杆菌感染部位中大量存在，并在体外对细菌和寄生虫起反应。研究发现分枝杆菌中的有效成分是非肽的低分子量（1～3 kD）的化合物，包含碳水化合物骨架和磷酸成分。Constant 等从结核杆菌H37RV株中分离到4种不同的水溶物：TUBag1-4。TUBag4是5'-三磷酸胸苷，其γ-磷酸为一未被确定成分的低分子量基团所取代〔9〕。TUBag3与4结构相似，但为尿苷而非胸苷。1和2为3和4的非核苷酸片段，活性极小。TUBag4可刺激外周血Vγ9/δ2 T细胞的扩增和其它一些特异性的γδT细胞。这些化合物同时存在于微生物和哺乳动物中。由于从分枝杆菌培养滤液或提取物中分离天然抗原比较困难， Tanaka Y 等首先合成了一系列单个碱基的磷酸化合物，并发现其中一些，尤其是单烯基磷酸化合物(Monoethyl),可模拟Vγ9/δ2 T细胞对分枝杆菌的反应〔10〕。其后，他们又报道了此γδT细胞的天然配基：异戊烯焦磷酸盐(Isopentenyl pyrophosphate IPP)和相关的萜类(Prenyl)的焦磷酸化盐衍生物。而用磷酸基团代替焦磷酸基团则可大大削弱它们的抗原性。IPP和相关的萜焦磷酸盐是诸如维生素、脂类和类固醇等亲脂性化合物的活性前体。这些萜焦磷酸盐中间物同时存在于细菌和哺乳类细胞中，人Vγ9/δ2 T细胞亚群对它们的识别也许可以部分解释其对一系列肿瘤细胞系的反应性。上述研究都使用了活化的γδT细胞系，无APC和额外的细胞因子的存在。后继的多数研究结果进一步显示磷酸基团活化γδT细胞需要T-T细胞相互作用，而识别本身则不需要MHC Ⅰ/Ⅱ类分子、CD1、TAP1/TAP2或DMA/DMB的表达。尽管个别研究体系中有APC的存在，但认为是非MHC限制性的，其作用可能与提供γδT细胞生长所需的细胞因子有关。 而Carena 等的研究进一步显示APC表面MHC分子在γδT细胞识别磷酸基团配体中的特殊含义〔11〕。CD94（NKG2-A/B异质二聚体）是大多数γδT细胞表面表达的与MHC I类分子可发生特异性结合的受体。他们发现，CD94与MHC I类分子结合时可下调磷酸化配基对γδT细胞的激活。当该配基处于低浓度时，CD94的抑制作用更明显，从而提高了γδT细胞激活的阈值。在生理情况下，该机制对防止自身免疫应答具有重要意义。 另外一个重要的问题也初步得到了澄清，即TCRCDR3的多样性对Vγ9/δ2 T细胞磷酸化配基的特异性是否产生影响。通过取用一群随机的细胞克隆和不同配基的检验发现，所有的克隆都显示了相同形式的交叉反应性。要想选出对单一配基有特异性的克隆是不可能的。而且，无论用强的或弱的刺激物来扩增，T细胞系或克隆都显示了相同形式的交叉反应性〔12〕。虽然存在此种交叉反应性，但就配基结构而言，这些细胞是高度特异的。磷酸基团的数目和位置以及碳链骨架的类型对T细胞的活化都至关重要。因此，Vγ9/δ2 T寡克隆T细胞亚群具有广泛的交叉反应性而又是配基特异的。 热休克蛋白（hsp） 在1990年前后，有大量的报道显示γδT细胞识别热休克蛋白家族成员。识别hsp的外周血或脐血γδT细胞亚群的表型主要为Vγ9/δ2 ,具有丰富的连接区多态性，最初的发现来自于细菌感染。人类和小鼠γδT细胞识别的主要hsp家族成员为hsp60和hsp65〔13〕。随后又发现一些肿瘤细胞表面高表达热休克蛋白可活化Vγ9/δ2 T细胞，如Daudi淋巴瘤表面hsp60和肺癌细胞表面的hsp72等〔14，15〕。热休克蛋白的单克隆抗体则至少可部分抑制该反应。该反应与靶细胞表面热休克蛋白表达含量呈正相关。在一些自身免疫性疾病中，γδT细胞对靶细胞表面hsp的识别也被证实，如γδT细胞可识别多发性硬化病人少突胶质细胞表面hsp并引起细胞杀伤〔16〕。 hsp作为一类高度保守的分子伴侣蛋白，广泛存在于原核和真核生物细胞中。除了构成性表达之外，在如高温、低氧、放射、感染、中毒等各种应激条件下均可诱导其高表达。热休克蛋白在蛋白折叠、转送和亚基装配中起不可或缺的作用,而且它们在许多免疫应答过程中也发挥作用。它们与一系列蛋白和肽段结合并参与抗原呈递，使得APC能处理其结合的肽段而形成稳定的MHC I类分子-肽段复合物。另一方面，通过在细胞表面表达，hsp也可能作为抗原呈递分子起作用〔17〕，因为它的三维结构N-端肽段结合位点与MHC I类的肽段结合位点的结构相似。 在各种应激条件下，由于hsp诱导高表达而造成了γδT细胞的激活。通过其产生细胞因子和细胞毒活性的作用，γδT细胞可能发挥快速清除应激因素和受损细胞并且启动后继免疫反应的作用。 3 γδT细胞抗原识别的结构基础 综上所述，γδT细胞对抗原的识别与αβT细胞并不相似，而更类似于Ig对抗原的直接识别，并且无MHC限制性。TCRγδ与TCRαβ分子结构比较研究分析结果在一定程度上为此种作用差异性提供了解释。 TCRαβ和TCRγδ的二级结构与Ig类似。它们三者都通过重组V、D、J形成单一的Ig或TCR，从而形成对抗原的特异性。X线衍射研究结果显示Ig和TCRαβ的CDR3环均是识别肽段的关键结构，因此推测γ/δ链的相似区域也起类似作用。Rock 等分析了从小鼠到人Ig和TCR受体链的CDR3长度〔18〕。Ig轻链上CDR3短且长度相对固定，而重链CDR3长且长度范围变化大，这可能提示Ig识别从小分子到大的病原体较大范围内许多不同大小的抗原。TCRαβ的CDR3长度分布范围窄，且α、β链的CDR3长度相近，这可能反映出αβ链的功能需要，即同时接触MHC和结合肽段。TCRγδ的γ链CDR3短，长度范围小，而其δ链CDR3长且变化范围大，因此就CDR3长度而言，TCRγδ更类似于Ig而非TCRαβ。 在混合淋巴细胞反应中，与αβT细胞同种异体反应性克隆相比，识别同种异体MHC分子的γδT细胞克隆频率是很低的；而且大多数细胞克隆有很高的交叉反应性，这在αβT细胞同种异体反应性克隆中是极罕见的，这提示TCRγδ对MHC的反应类似于Ig对MHC的识别。 4 结论与问题 γδT细胞抗原识别的多样性和机制复杂性使人们目前尚难以概括γδT细胞全部的生物学意义。然而现有的研究结果似乎已经揭示了γδT细胞基本功能特点。γδT细胞对抗原的非MHC限制性和无需抗原处理和呈递识别方式提示，在机体内出现机体异常变化（如应激）时，γδT细胞可作出比αβT细胞更迅速的反应。此外，γδT细胞可对αβT细胞不能识别的抗原产生应答，在功能上与后者实现互补。另外，γδT细胞免疫监视功能具有广泛性，因为其识别配体如hsp 及磷酸类小分子物质在自然界中是普遍存在的。在历经长期进化后，通过APC对抗原肽的复杂处理与加工及精确呈递，αβT细胞实现了其高度抗原特异性、严格MHC限制性和周密职责分工（Th和CTL）的免疫应答特点，使免疫系统高效、协作有序而针对性极强地清除外源生物分子或病原体。而γδT细胞则以更广泛、快速和直接的方式对体内应激事件作出反应，同时其反应手段较为笼统，即γδT细胞可同时发挥细胞毒和分泌细胞因子双重功能；但是在某些特定部位如上皮，表达特定和单一TCR受体的γδT细胞似乎为局部高频突发事件而存在。总之，在免疫应答过程中，γδT细胞可能发挥着启动、协调与互补αβT细胞功能的作用。 γδT细胞抗原识别的研究目前在许多方面仍有待深入。γδT细胞识别蛋白抗原时所需要的基本结构要求是什么？在γδT细胞激活中，hsp到底通过何种途径起作用仍然很不明确。γδT细胞对细胞表面hsp分子的识别是直接识别，还是识别其呈递的肽段？事实上，hsp所携带的肽段的作用尚未被明确而完整地研究过。TCR的CDR3多样性究竟有何意义？既然hsp、磷酸类代谢物同时是自己和非己成分，为什么自身反应性的γδT细胞克隆在其发育中未被从细胞库中选择掉? 在这些物质引起的免疫反应中，γδT细胞的特异性是否同时指向外来物和自体成分？只有这些问题的全部澄清，人们才可对γδT细胞的生物功能作出全面和深刻的评价，并且可将其理论成果用于肿瘤和自身免疫病等的治疗。 自94年始，我们对γδT细胞的特性、分布、亚群、受体分子的选择性取用、功能特点及其在肿瘤和自身免疫病的参与作用进行了系统的研究，以期为揭示其功能之谜提供资料和促进其理论成果在疾病的预防、诊断和治疗中的应用。 作者简介：何维，男，43岁。留德医学博士，教授，博士生导师，中国协和医科大学基础医学院副院长，中国医学科学院基础医学研究所副所长。中国免疫学会基础免疫分会委员,北京免疫学会理事,《国外医学免疫学分册》、《中华微生物学和免疫学杂志》、《中国免疫学杂志》编委。94年回国工作后共主持国家重点基础研究发展项目（973）课题、95攻关课题、国家自然科学基金、863生物高科技计划、卫生部基金、国家博士点基金、教委基金和中美、中日和中德合作研究项目及医科院各种课题15项。科研集中在γδ型T细胞在抗感染免疫、肿瘤免疫和自身免疫中的作用，IL-15基因克隆与表达研究及其IL-15转基因瘤苗抗肿瘤作用，超氧化与免疫在衰老中的关系，胸腺退化的基因调控和老年性痴呆免疫学诊断等方面。目前共发表论文35篇（国外8篇），出版专著两部，获省部级科研二等奖一项。

细胞表面的蛋白具有识别功能

其实很多药物对肿瘤都有一定的抑制或杀灭作用，但只要是应用于口服的药物就要考虑人体所能吸收的形式，所以完全指望某种口服药物起到抑制肿瘤的作用很不科学！目前中医中药正规者也不过是能提高机体自身免疫，促进人体抗癌基因的活性，从而起到抑制肿瘤细胞快速分裂增值的作用，所以国家对于口服中药要求一定只能标注“肿瘤辅助用药”！