有关巨噬细胞功能性研究的论文

肿瘤微环境研究大剖析——肿瘤相关巨噬细胞 肿瘤免疫微环境是肿瘤与宿主免疫系统之间竞争博弈的主战场，肿瘤微环境（TME）中各种细胞之间的相互作用造成免疫细胞具有依赖于TME的双重作用，并决定肿瘤相关免疫反应的结果——即免疫系统对肿瘤细胞的攻击或耐受。 肿瘤内的免疫细胞包括介导适应性免疫反应的细胞（如T细胞、B细胞等），以及介导天然免疫反应的效应细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞等），而肿瘤相关巨噬细胞(TAM) 是肿瘤微环境研究中最为热门的免疫细胞亚群。越来越多的研究表明TAM具有支持肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等一系列促进肿瘤发展的功能，与肿瘤患者的不良预后呈高度相关性。由不同巨噬细胞表型定义的亚型（M1促炎型和M2型抗炎型），与肿瘤预后的关联也有着广泛的研究，在结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌食管癌、乳腺癌、胰腺癌等癌种中，均有大量研究报道，并证实两个亚型在预后关联上的负相关性。然而如何精准的找出不同组间TAM的表达谱差异、诠释机理并结合现有的免疫疗法，实现冷热肿瘤的转换将成为抗肿瘤治疗的研究新方向。 巨噬细胞广泛分布于各种组织中。通过对不同组间巨噬细胞表达谱的对比，存在于特定组织中的巨噬细胞按其组织位置可分为肝脏中的Kupffer细胞、脑中的小胶质细胞、骨组织中的破骨细胞、肺中的肺泡巨噬细胞、肾脏中的系膜细胞和淋巴中的被膜下巨噬细胞等。不同组织中的巨噬细胞具有不同的转录和表达谱。 根据表型和功能，巨噬细胞可以分为M1(促炎，经典激活的巨噬细胞)和M2(抗炎，交替激活的巨噬细胞)两种主要类型(图1)，此外还发现其他三种巨噬细胞：肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)、CD169+巨噬细胞和TCR+巨噬细胞。 截止到目前的认识，TAM具有从M1到M2样表型的特殊过渡期，这意味着它们在整个肿瘤进展过程中不仅仅属于M1或M2样表型。在肿瘤起始的早期阶段，TAM在转移到M2样型之前为M1样表型。此外，必须指出，类似巨噬细胞的M2还被进一步划分为4个子类型，即M2a、b、c和d，不同子类型的标记也不同。 M1和M2型巨噬细胞标志物分类汇总 表面分子： M2型巨噬细胞表达高水平的CD206、CD163和TGFβR，而M1型巨噬细胞表达高水平的CD40、CD80和CD86。 转录因子： STAT1和STAT3在M1表型中高度激活，STAT6在M2表型中高度激活。IRF3、5和7在M1表型中被激活，而IRF4在M2表型中被激活。 细胞因子和趋化因子： 在M1型巨噬细胞检测到TNFα、IL1β和IL12等因子的高表达，在M2型巨噬细胞检测到IL10、ALOX15和CCL18等因子的高表达。在M1型巨噬细胞当中iNOS高表达，在M2型巨噬细胞当中Arginase 1高表达。 此外，初级TAM可以通过分泌CCL2、CCL5、CCL7、CXCL8和CXCL12等趋化因子招募单核细胞，在IL4、IL6、IL10、IL13以及TGFβ刺激作用下发生极化，具有类似于M2型巨噬细胞的表型，并分泌多种细胞因子（如TGFβ、IL-10等）和趋化因子(招募Th2和调节性T细胞)，介导免疫抑制效应；分泌多种细胞因子、生长因子(如EGF、VEGF、PDGF、FGF和TGFβ）、基质金属蛋白酶(MMPs)、M-CSF等分子，促进慢性炎症、血管新生、肿瘤侵袭和调节免疫反应(图2)。在这个过程中，TAM通过分泌多种因子与肿瘤微环境多种类型细胞发生相互作用和影响，并进而介导复杂的效应(图3)。 用什么方法对肿瘤微环境当中的TAM进行分析和评估呢？ 我们通过一篇发表在Cancer Microenviron的研究论文，来介绍一些基础技术。文章中分三步对非小细胞肺癌(NSCLC)患者和非肿瘤患者组织中的TAM进行分析，具体如下： 首先，此研究使用免疫组织化学(IHC)来确定与同一患者的非肿瘤组织相比，非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织当中TAM表型可能发生的表型变化。分别使用CD68（通用巨噬细胞标记）、iNOS（M1）和CD163（M2）抗体测定TAM表型。 然后，作者对不同类型NSCLC患者肿瘤组织及非肿瘤组织当中CD68、iNOS及CD163阳性染色面积占比进行了统计学分析。结果表明，与非肿瘤组织相比，在所有NSCLC亚型肿瘤组织当中CD68和M2型巨噬细胞标记CD163均明显增加(P≤)。与之相对，与非肿瘤组织相比，在肺腺癌患者和鳞状癌患者组织当中M1型巨噬细胞标记iNOS的表达降低，显著性分别为P≤及P≤，但大细胞癌患者组织当中M1型巨噬细胞标记iNOS的表达与非肿瘤组织相比无明显差异。 接下来，作者利用多因子液相芯片技术(Bio-plex)对不同类型NSCLC患者及正常对照血清当中介导Th1型和Th2型免疫反应相关多种细胞因子进行了检测和分析。结果表明，与正常对照相比，只有大细胞肺癌患者血清当中IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8的水平增加，在其他类型的NSCLC患者当中并未发现明显变化。 非因小结 肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对肿瘤的生长、转移及耐药起着重要调控作用，使得TAM成为抗肿瘤转移治疗的重要靶点。TAM功能的可塑性，使它能够通过响应于肿瘤微环境的信号分子(如细胞因子、药物)而改变自身的功能状态，因此针对TAM的深入研究具有重要的科学意义和临床价值，为肿瘤的治疗开辟新的思路和途径。 非因生物的DSP空间多组学技术可以通过对TAM的精确定位来实现不同空间组定义的巨噬细胞亚群表达谱差异的分析 （图4），从而深化科研人员对肿瘤微环境的研究。非因DSP空间多组学技术通过在单张切片上选择合适的兴趣点（Region of Interest，ROI），来实现基于每个ROI微环境的100重蛋白或＞18,000重全转录组的原位表达谱分析，是针对肿瘤免疫和肿瘤微环境设计的高精度、多维度分析的新一代空间组学技术。目前已经成功开发了针对DSP蛋白组和转录组分析的TAM研究流程，欢迎各位老师前来咨询。（该文章部分内容转自ABclonal）

心脏肥大是对心脏各种刺激的代偿反应，但在持续压力下，会导致心力衰竭。有研究表明，巨噬细胞在代偿性到失代偿性肥大转变中发挥重要作用，但其在心脏超负荷早期及心衰进展中的确切作用尚不明确。因此来自尼苏达大学医学院和密歇根大学的研究团队对此展开研究， 发现来自心脏自身的免疫细胞或许可以帮助我们对抗心力衰竭 。其研究成果以题为“Cardiac Resident Macrophages Prevent Fibrosis and Stimulate Angiogenesis“在线发表于《Circulation Research》（IF=）杂志期刊。

首先研究人员通过质谱流式细胞（CyTOF）剖析了假性手术（Sham）以及TAC术后1周以及4周后的心脏非心肌免疫细胞亚群丰度。研究发现TAC术后1周小鼠的CD64+F4/80+mψs细胞富集最多，其次为单核细胞、树突状细胞、多型核白细胞（PMNs）以及B细胞（Fig 1. A-B）。CD11b+CD64+mψ细胞亚群表达不同水平的CX3CR1、CD206、MHC-II、CCR2和Lyve-1（Fig 1. C）。随后研究人员基于CD11b、CD6418、Timd4、CXC3CR1和CCR2进一步分析了驻留巨噬细胞（Res）和单核细胞衍生巨噬细胞（MoMF）变化，研究发现TAC术后1周，Res和MoMFs mψs占比显著升高，并在术后4周恢复至假性对照水平（Fig 1. D）。此外，基于CCR2和MHCII表达的圈门策略同样发现术后1周，CCR2-亚群表达占比增多（Fig 1. E)。 这些结果表明mψs细胞在心脏肥大性重塑过程的早期发挥重要作用。

 CyTOF深度剖析压力过载引起的心脏免疫细胞重塑

为了进一步研究心脏mψs在心脏压力负荷早期时的响应，研究人员对4个假性手术和TAC术后1周小鼠的心脏免疫细胞进行了单细胞转录组测序，发现单核巨噬细胞对心脏负荷响应最强，其次为T细胞和B细胞（Fig 2）。

 scRNA-seq剖析压力负荷引起的心脏免疫细胞表型

随后研究人员进一步分析了驻留及招募mψ细胞亚群的转录表达谱，发现Res Mψs和MoMFs间具有不同的细胞内在调控机制，比如Res mψs特异性表达Lyve1，CD163和CCl24，Timd4以及多种CC趋化因子配体；MoMFs细胞特异性表达Ccr2，MHC-II，Ccl5，Cxcl10，Ifit1、Il1b和纤维化介导基因Spp1、Thbs1和Fn1 等（Fig 3. A-C）。对调控差异基因的IPA分析发现，同MoMFs相比，Res Mψs中上游调控因子IL10RA、IL4、STAT3和IRF2通路激活，而IFNG、IRF3和IRF7调控基因下调（Fig 3. D）。

对假性手术和TAC术后小鼠样本的Mψs差异表达基因分析，TAC术后小鼠Res Mψs细胞Lyve1，Cd163， klf2、 klf4，AP-1转录因子（Jun，JunB，JunD），Fos 和 FosB，Nfκb，Ccr2、 Trem2、 cxcl10和 Lgals3基因表达上调（Fig 3. E）。差异表达基因的 IPA 分析预测了关键调节因子 NR1H2和NR1H3以及 STAT3和 STAT6信号的激活， IRF3和 IRF7以及 NFATC2，MYD88的抑制(Fig 3. F)。这些结果揭示了当心脏从适应性肥大状态过渡到心衰时，Res Mψs和 MoMF 中发生关键变化 。

 心脏驻留细胞的基因表达特征

研究人员利用CD115抗体耗尽mψs，进一步研究了mψs在心脏压力超负荷引起的适应性肥大反应中的作用。通过荧光流式和质谱流式研究发现，注射CD115抗体的TAC术后小鼠心脏免疫细胞，尤其是心脏mψs细胞表达显著降低（Fig 4. B-C)。尽管Res  mψs细胞耗尽，但不会显著改变心脏压力超负荷引起的心肌肥大，射血分数和缩短分数（Fig 4. E）。

 CD115介导心脏巨噬细胞耗竭

尽管mψs对心脏超负荷前期的肥大影响较小，但TAC术后mψs细胞中促炎细胞因子IL6和抗炎细胞因子IL10以及转化生长因子Tgfb1表达升高，表明整体免疫活化(Fig 5. A-B)。此外，Res  mψs细胞损耗会加重心脏的纤维化（Fig 5. C-D）。与假性手术组相比，TAC术后小鼠会表达更高水平与心脏纤维化发展相关的的细胞因子和生长因子（TGFβ、IL10），且TGFβ和IL10与肌成纤维细胞分化、肌成纤维细胞生长和胶原生成呈剂量依赖性关系(Fig 5. E-F)。这些结果表明 心脏mψs在缓解压力过载引起的纤维化中发挥着关键作用。

驻留巨噬细胞抑制心脏纤维化

TAC术后小鼠mψs 中检测血管内皮生长因子(Vegfa)的表达上调，且TAC术后能够增加心脏微血管密度，CD115抗体处理能够钝化微血管密度（Fig 6. A-B）。为了进一步研究mψs在微血管调节中的作用，研究人员将mψs与脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)共培养，研究发现心脏mψs 能够刺激血管生成。

驻留巨噬细胞刺激血管生成

通过CCR2 KO和C57Bl/6j小鼠模型，研究人员进一步验证了MoMFs能够促进纤维化这一假设。尽管未观察到CD115抗体阻断对TAC术后1周小鼠心脏肥大及其功能的影响。但相比于C57Bl/6j小鼠，CCRO小鼠显示较低程度的纤维化，表明 MoMFs的促纤维化作用 （Fig 7. C-E）。此外，同时缺乏Res mψs和MoMF的CCR2KO小鼠未受纤维化影响，表明 MoMF是心脏纤维化的有力促进者，其过程最终取决于Res mψs对纤维化的抑制作用。

 单核细胞巨噬细胞能够促进纤维化

最后研究人员检测了TAC术后6周的心功能以评估了α-CD115治疗后的长期响应。研究发现术后6周，免疫细胞数量（包括Res mψs以及MoMFs）变化没有显著差异，但TAC术后小鼠心肌细胞横截面积增大，纤维化程度较高，尤其是CD115抗体治疗TAC小鼠（Fig 8. C-F）， 表明Res mψs在心脏负荷早期预防心脏功能恶化和防止纤维化发展发挥重要作用。

巨噬细胞耗竭能够加速心衰发展

该研究中，研究人员结合了CyTOF，scRNA测序研究了心脏负荷早期免疫细胞的重构。研究鉴定了不同的mψs亚群，分析了其在心脏负荷早期的亚群丰度变化及基因表达差异，确定了Res m ψs以及MoMFs在心脏负荷早期 调节中的重要作用。随后研究人员通过阻断或基因敲除小鼠模型，将巨噬细胞耗竭，研究发现Res mψ s耗竭会导致心脏中血管的生成反应减弱，心脏的纤维化程度会增加。尽管后续巨噬细胞得以恢复，但是早期耗尽巨噬细胞的心脏依旧出现了心脏功能的降低和纤维化，说明心脏中的巨噬细胞在早期预防心力衰竭中就有着重要的作用。 该研究为更好地理解心脏巨噬细胞刺激和补偿调节机制以及心衰的靶向治疗提供了参考。

【参考文献】

Revelo X,  et al. Cardiac Resident Macrophages Prevent Fibrosis and Stimulate Angiogenesis.  Circ Res. 2021.

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巨噬细胞（Macrophage, M）是一类位于外周血，炎症组织中的白细胞。在动物体内主要通过吞噬细菌，死亡细胞及细胞残片等作用参与非特异性免疫调节（先天性免疫）而随后将吞噬的物质消化并将其特征递呈倒后续淋巴细胞及其他免疫细胞参与特异性免疫调节（后天性免疫）。

巨噬细胞隶属于免疫细胞中单核细胞类群，其主要来源为造血干细胞。造血干细胞能够分化为髓样干细胞及淋巴样干细胞两个类群，髓样干细胞后续主要分化为单核细胞，红细胞及血小板等细胞类群而淋巴样干细胞后期主要分化为T，B及NK细胞等。巨噬细胞主要由造血干细胞，单核细胞（Monocyte，注意与单个核细胞mononuclear cell是不一样的，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞），巨噬细胞分化顺序分化而来。

图1 免疫细胞分化类群

巨噬细胞首先在骨髓中发育形成单核细胞，巨噬细胞进入血液后以单核细胞的前体形式存在。当单核细胞浸润在组织及器官之中后，最后分化完全，成为巨噬细胞。巨噬细胞主要存在于淋巴结，肺泡壁，骨髓，肝脏以及脾脏等器官。

巨噬细胞根据功能及炎症因子分泌水平分为M1型巨噬细胞及M2型巨噬细胞两种亚群。M1巨噬细胞（经典激活巨噬细胞），主要由LPS及IFNγ激活，分泌高水平的IL2及较低水平的IL10，主要起到促进炎症发生发展，杀菌及吞噬等作用。而M2巨噬细胞（交替激活巨噬细胞）主要由IL4炎症因子激活，主要通过分泌IL10等抗炎细胞因子抑制M1巨噬细胞，在伤口愈合及组织修复等进程中起作用。

图2 M1/M2细胞分化示意

在临床研究中，研究人员主要通过M1，M2巨噬细胞表面marker及炎症因子表达水平进行M1，M2类群分析。如利用F4/80，CD80，CD206流式抗体通过流式细胞仪分析细胞亚群中M1，M2细胞比例。也可以通过qPCR，ELISA等研究方法研究IL10，TNFα等炎症因子表达水平分析M1，M2细胞类群分类比例。具体marker选择可以参考相关网站： 。

、巨噬细胞亚型在炎症疾病中研究

M1型巨噬细胞在体内主要起到吞噬细菌等外来物质及凋亡细胞碎片等内源性物质，起到保护组织器官免受外来物质侵袭。在炎症性疾病中，M1型巨噬细胞在早期炎症部位富集，并被LPS，TNFα，IFNγ等促炎因子激活，并随后通过分泌IL12等炎症因子的方式促进炎症的发生发展，保护机体免受外来物质侵袭。而在炎症后期，M2细胞则起到了抑制炎症，修复组织，及组织结构重建等作用。在炎症发生发展M1/M2巨噬细胞类群数目比例随着时间的推移不断变化，最终完全消除炎症的影响。而在某些慢性炎症及特定急性验证进程中，M1/M2细胞类群比例失调，过度M1细胞类群激活会导致组织严重损伤，并导致后续更严重的炎症因子风暴等不良症状。

因此，在炎症疾病治疗中可以通过抑制M1细胞类群数目，提高M2细胞类型比例的方式对炎症开展治疗。

、巨噬细胞亚型在肿瘤疾病中研究

肿瘤相关巨噬细胞（tumor associate macrophage，TAM）指被募集到肿瘤微环境中的巨噬细胞。早期研究认为巨噬细胞具有抑制肿瘤的作用，但是后续研究发现TAM能够通过抑制免疫反应，促进血管生成，刺激肿瘤细胞浸润及转移等机制促进肿瘤恶化。

图3 TAM在肿瘤发生发展中作用

TAM作为肿瘤微环境中重要的细胞组成部分，在肿瘤微环境组成及功能构成方面起到了重要的作用。肿瘤微环境中TAM细胞多数表现出M2型巨噬细胞特征，高表达IL10，起到抑制肿瘤微环境免疫反应的作用。而后续肿瘤微环境的研究也证明M1/M2比例失调是肿瘤发生发展，免疫逃逸以及后续转移耐药等疾病进程中起到关键作用。因此以巨噬细胞极化为治疗靶点的抗肿瘤药物开发及治疗也是当前治疗的重点。

巨噬细胞是先天免疫系统的重要成分，以高度异质性和可塑性为特征。研究不同亚型巨噬细胞在不同疾病及肿瘤中的功能能够通过调控免疫系统活性的方式调控疾病发病进程起到事半功倍的作用。因此，掌握巨噬细胞相关背景知识也是研究人员必备技能储备。