光学学报超分辨成像专题

这个问题的答案比较简单：因为组成视网膜的每一个感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、相机芯片上的每一个感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。比如视网膜中央凹区域的视锥细胞直径平均约为 5 微米。而由于奈奎斯特-香农采样定理的限制，视网膜上能分清的两个相邻像点的距离是视锥细胞直径的两倍，即 10 微米。再结合眼球的构造，大致可以推断出，在距离眼睛 25 厘米的位置，我们能分辨物体上相距为 80 微米的两个点，换算成点阵密度就是大约 320 ppi，这也是苹果所谓“视网膜屏”分辨率的来历。如果要观察小于 80 微米的物体，比如细菌，就需要先将物体放大，再用眼睛或者相机观察。现代光学显微镜的构造其实非常简单，样品放置在物镜的焦点处，从样品上发射或散射的光经过物镜变成平行（准直）光，再经过一个结像透镜，然后会聚到相机的感光芯片上成像。按照前面的方法来推算，要区分物体上相距为 200 纳米的两个点，如果使用科研级相机，比如最近火起来的 sCMOS 相机（每个感光像素尺寸为 微米），只需要使用放大倍率为 65 倍的物镜就足够了。那么是否可以通过提高物镜的放大倍率来观察低于 200 纳米的物体，比如细胞里面微管呢？答案是不可以。

生物物理学前沿。。。。同僚同死

撰文 | 十一月

责编 | Qi

超分辨率显微镜逐渐成为生物学研究中有力的工具，但是获取大量不同目标样品的多路图像仍然具有挑战性。在这种情况下，DNA-PAINT技术 （DNA point accumulation in nanoscale topography） 【1】 应运而生。DNA-PAINT技术是指通过短荧光标记的寡核苷酸用于纳米级定位成像的点积累短暂结合，可以在固定细胞内实现简单且易于实现的多路3D超分辨率成像并可以在体外实现纳米级别的空间分辨率 【1】 。但是DNA-PAINT技术存在一定的技术性限制，由于细胞核内的靶标与探针的DNA-DNA的杂交会造成信号背景较高。

近日，来自德国柏林自由大学H. Ewers 研究组在 Nature Biotechnology 杂志上发表了一篇题为 “Left-handed DNA-PAINT for improved super-resolution imaging in the nucleus” 的文章，建立了新颖的左手螺旋DNA-PAINT技术 （L-DNA-PAINT） ，对先前的DNA-PAINT技术进行了进一步的优化，大大提高了该技术的分辨率以及超分辨成像中的多路复用能力。

超分辨率显微镜技术提高了人们对于细胞内结构细微之处的认识。 单分子定位超分辨率显微镜 （Single-molecule localization super-resolution microscopy， SMLM ） 通过每次几个分子的连续成像来实现对单分子纳米级分辨率的记录 【2, 3】 。DNA-PAINT技术是通过DNA杂交进行的，使用明亮的、光稳定的有机染料来获得最大的单分子定位分辨率。然而，任何的DNA分子在统计的平均值来说有22000个互补结合位点，这可能会导致DNA-PAINT技术的假阳性的出现。此外，转录组中也会出现不必要的DNA-RNA杂交。为了克服这一问题，作者们使用了左手螺旋的L-DNA来优化DNA-PAINT技术。L-DNA的物理化学性质与R-DNA基本相同，但是L-DNA在自然情况下不存在且不会与R-DNA之间杂交 【3, 4】 （图1a-b） 。

首先，作者们对L-DNA-PAINT技术的表现进行了检验。作者们将HeLa细胞中的微管结构作为检验的平台，实验发现无论是R-DNA-PAINT还是L-DNA-PAINT技术都能够精准地表现出微管的中空结构 （图1c） ，并且两者的分析分辨率均能够达到33-39nm左右。因此，作者们认为L-DNA-PAINT技术与R-DNA-PAINT技术在分辨率方面表现相似。 进一步地，作者们对两种技术对基因组DNA的杂交潜力进行检测。作者们发现，与R-DNA-PAINT技术相比，L-DNA-PAINT中细胞核中的定位降低到细胞质中的背景水平。另外，作者们对两种技术的假阳性情况进行了检测。通过BrdU （非天然核苷酸） 整合到DNA复制位点的实验，作者们发现L-DNA-PAINT实验中可以对特定的复制中心进行精准标记。

DNA-PAINT技术一个重要的亮点是可以对多个目标位点进行可视化研究。 通过使用不同的L-DNA成像结合子 （Imager-binder pairs） 对PCNA以及Ki67进行染色，作者们发现两种分子都可以被染色，并且与先前报道的在细胞核内的定位类似 【5】 。

总的来说，作者们所建立的优化版L-DNA-PAINT技术具有与传统R-DNA-PAINT相同的特异性、分辨率以及多路复用的能力，但R-DNA-PAINT技术相比具有更低的假阳性率以及更低的背景。未来，L-DNA-PAINT技术作为单分子定位超分辨率显微镜技术的重要实验方法能够更加精细地在纳米级别分辨率上可视化以及定量化DNA相关的分子，为进一步地对细胞内的结构进行解析提供了“更优解”。

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制版人：琪酱

参考文献

1. Jungmann,R. et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT andExchange-PAINT. Nature methods 11, 313-318, doi: (2014).

2. Rust, M. J., Bates, M.& Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic opticalreconstruction microscopy (STORM). Nature methods 3, 793-795,doi: (2006).

3. Betzig, E. et intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science (New York, .) 313, 1642-1645, doi: (2006).

4. Hauser, N. C. et the left-helical conformation of L-DNA for analysing different markertypes on a single universal microarray platform. Nucleic acids research 34,5101-5111, doi: (2006).

5. Chagin, V. O. et al. 4DVisualization of replication foci in mammalian cells corresponding toinpidual replicons. Nature communications 7, 11231, doi:(2016).

无透镜全息显微镜“CyteLive”采用的是定量相位成像技术，可以在无需对细胞进行任何染色标记的前提下，实现长达数天的连续观测，不仅细胞细节清晰可见，还能准确还原其三维影像，可谓“360度全方位无死角”。“CyteLive”在构造上，它抛弃了传统显微镜的光学镜头，只保留光源和传感器，实现了小型化和轻量化，单手即可托起；它的体积仅有传统显微镜的，可直接放在细胞培养箱里进行活细胞箱内观察。与传统的显微镜不同的是，“CyteLive”通过先进的计算成像算法，把样品聚焦图像“算”出来，借助自适应超分辨成像技术，成像分辨率可突破至像素尺寸的三分之一，没有物镜却可以实现20倍物镜的成像水平。当然，“CyteLive”单幅成像像素还可高达一亿像素，也可同时观测数万个红细胞，这个是传统显微镜所不能达到的技术。不管是从操作，还是成像，或是观测方面，都不是传统显微镜所能比拟的，传统的显微镜只是一个单纯的光学仪器，从1931年，恩斯特·鲁斯卡通过研制电子显微镜开始，开启了一场生物学的革命，至今已经使用了几十年了，除了在镜片和校准方面不断的改善，设备的体积也越来越大，当然，如今的显微镜种类也很多，类似某种电子显微镜，微生物显微镜等，种类都繁多，但不管种类如何的多，但它们还有一个共性，那便是它们还是需要目镜和物镜的作用下，才能观测到那些细胞或其他物质，更重要的是，所观测的细胞等微生物，还离不开染色剂染色，这也使得传统的显微镜的局限性比较大。而新一代无透镜全息显微镜，其实早在国外也有应用，在此之前，我们国内很少能用得起的，这不仅是进口的问题，还有其他因素的影响。如今，南京理工大学团队所研制的新一代无透镜全息显微镜，将使我国在这一领域有所成就，结束国外对这一领域的长期垄断。