寨卡病毒药物研究论文

寨卡病毒是黄病毒家族中的一种虫媒病毒。寨卡这个名字最早是在1947年从非洲乌干达寨卡森林的一只发热恒河猴身上分离出来的。在过去的70年里很少有相关的研究发表，原因是它只会引起发烧、关节痛、结膜炎、皮疹等轻微症状，且症状在2015-2016年消失，然而不久村卡病毒突然在巴西、美国、东南亚爆发，迅速蔓延到世界61个国家和地区，并与流产、新生儿小头症和吉兰巴雷综合症病例的迅速增加密切相关。

2016年初，世界卫生组织将村卡病毒列为全球突发公共卫生事件，从而大大加快了全球村卡病毒研究的步伐，在短时间内更是建立了多种小鼠和非人灵长类动物的村卡模型，进行感染和被应用于村卡病毒诊断、治疗和疫苗的相关临床前评估。然而，到目前为止，寨卡病毒导致新生儿小头症的致病机制仍不清楚，相关的分子机制，尤其是神经系统的感染机制非常有限，这严重影响了抗病毒靶向药物的开发。

RNA干扰（RNAi）是一种由小双链RNA引发的转录后基因沉默过程。正常细胞自身RNA干扰的调控在细胞分化和发育中起着非常重要的作用。

细胞内转录产生的初始miRNA（pri-mirNA）被Drosha加工成miRNA前体（pre-mirNA），通过exportin-5转运器输出到细胞质中。细胞质中的内切酶Dicer将这些miRNA前体裂解成多个具有特定长度（约21至23bp）和结构的小双链Rnas，即成熟的mirnas。miRNA的一条链与含有Ago2的蛋白复合物结合，形成rnA诱导的沉默复合物（RISC）。RISC和具有miRNA同源区的mRNA序列特异性地结合，在结合部位劈开mRNA，并引起转录后的调控。最近的研究表明，神经细胞中Dicer酶的缺陷可引起神经发育的退化。

寨卡病毒“爆发式传播”已成为“国际关注的突发公共卫生事件”，但全球并无可有效防治寨卡病毒感染的疫苗或药物。中国医学专家经短短两年艰辛攻关，在抗寨卡病毒药物研究中获重要进展。

据悉，复旦大学基础医学院陆路、姜世勃研究团队与复旦大学附属公共卫生临床中心和军事医学科学院微生物流行病研究所研究团队，合作设计的“多肽类病毒灭活剂”可有效杀灭寨卡病毒，阻止其感染孕鼠及其胎儿，对研发防治寨卡病毒感染的药物有重大意义。这项成果于7月26日在线发表在国际权威期刊上，引起世界医学界关注。

据悉，寨卡病毒是一种有包膜、蚊媒传播的病毒。1947年，该病毒首次在乌干达的恒河猴体内分离得到。2007年以前，该病毒只零星感染人类，但2007年后人类出现爆发感染。截止2017年3月，全球约80多个国家或部落报道了该病毒的感染。为此，世界卫生组织将南美地区发生的寨卡病毒“爆发式传播”宣布为“国际关注的突发公共卫生事件”。

据了解，两年前，陆路、姜世勃研究团队首先对寨卡病毒E蛋白的序列进行分析和研究，成功地研发出了一种能够灭活寨卡病毒的多肽候选药物(Z2)。研究人员发现该多肽可与寨卡病毒的表面蛋白结合，最终使病毒失去感染活性。体外细胞模型及体内动物模型上的实验结果亦显示Z2多肽可较好地抑制寨卡病毒的感染。

研究人员进一步研究发现，Z2多肽具有穿透胎盘屏障的能力，不仅能够降低寨卡病毒感染孕鼠血清中的病毒滴度，还能显著降低胎盘和胎儿寨卡病毒的感染率，阻止寨卡病毒的垂直传播。此外，该多肽灭活剂对孕鼠及胎鼠均表现出较好的安全性，有望发展为可防治寨卡病毒感染的新型药物，尤其适用于孕妇等寨卡病毒感染的高危人群。

利用基因沉默疗法 ，这样就可以很好的进行保护了，并且可以解决许多问题，这和小细胞外囊泡是有关系的。

反向遗传学 被认为是一种不可或缺的工具，它彻底改变了我们对病毒发病机制和疫苗开发的认识。大型的RNA病毒基因组，如冠状病毒基因组，由于基因组较大且不稳定，很难在大肠杆菌宿主中克隆和操作。 两位通讯作者均来自瑞士的University of Bern Transformation-Associated Recombination cloning  TAR克隆 基因组DNA片段和过量的TAR载体在去除细胞壁的酵母细胞中进行混合。每个载体中都含有对目的基因特异的两段序列（标为蓝色和红色）以及酵母的筛选标记HIS3和CEN6（淡蓝色原点）。由于载体过量，酵母细胞便会将DNA片段全部接受。根据具体情况又可分为三类：1）未分到基因组DNA的；2）分到基因组DNA但未被整合到TAR载体上的；3）分到基因组DNA且通过自身同源重组被整合到TAR载体上的。显然我们是只需要第三种情况的阳性克隆，怎么把其它两种过滤掉呢？答案是进行电泳。 下图是对上述过程的简化示意： 2010年5月20日，J. Craig Venter Institute在美国 Science  杂志上报道了首例人造细胞的诞生。向山羊支原体  Mycoplasma capricolum  细胞中转入人工合成的蕈状支原体 Mycoplasma mycoides  的基因组而来，产生的人造细胞表现出的是蕈状支原体的生命特性。利用该平台，研究人员在拿到合成DNA片段后一周内，对新冠病毒进行了基因组改造和病毒拯救。研究团队于1月14日向试剂公司下单，以化学合成方式得到上述14个DNA片段，并在2月4日拿到其中的12个含片段载体（有pUC57、pUC19、pUC57mini和PCC1-His3）。其中片段5 和7 未获得，原因不详。研究团队最终通过对一位来自慕尼黑患者的新冠病毒样本（BetaCoV/Germany/BavPat/2020）进行RT-PCR 扩增，获得了第5和第7个片段。 利用TAR 克隆，研究人员获得了6 组正确组装的新冠病毒构建体的分子克隆。随后用酵母的同源重组系统依据末端重复的序列将这些DNA 序列拼到一起。获得完整的病毒序列后，用T7 RNA 聚合酶将其通过脱落转录，得到病毒RNA，将该RNA 用电穿孔技术导入到非洲绿猴肾细胞（VeroE6 cell）中，使其感染。将用于培养绿猴肾细胞（~2d），含释放出的病毒颗粒的上清液注入到别的培养基中，发现可以感染别的细胞，说明新构建的酵母合成平台可以拯救病毒。 同理，作者团队在鼠肝炎病毒A59（MHV-A59）和MERS-CoV进行病毒拯救的测试，发现效果依旧很好，测试的克隆中正确组装了病毒基因组的YAC均可达到90％，这表明病毒在酵母中的组装效率相当之高。 TAR 克隆系统的一个最重要的优点就是可以先对全基因组进行设计，通过对小的具有重复序列的片段的合成，进而再依靠酵母的同源重组系统进行片段的正确组装，极大的降低了合成的难度，也大幅提高了合成的效率。无需得到变异毒株的临床样本，通过对病毒变异的分析，可以合成构建出该变异毒株的基因组片段，再通过酵母平台进行重建与拯救。论文中还提到对局部片段的重新设计，以测试改变前后对病毒的影响。 总的来说，这一方法即利用酵母人工染色体在酵母体内将合成的SARS-CoV-2的DNA片段进行体外重组，获得全长cDNA克隆。再将cDNA体外转录为RNA，利用电穿孔将病毒RNA转染进哺乳动物细胞，实现病毒拯救。 化学合成的基因组DNA所产生的SARS-CoV-2可以绕开病毒分离物的来源限制，而且还可以对单个基因进行遗传修饰和功能表征。 对于这一篇论文，我起初有许多地方不明白。 首先是病毒的基因组合成，理论上讲，比病毒更高级的生物基因组，并不是没有人合成出来过，因此这篇论文的技术可以说是降维打击了，那为什么还可以发表在顶级杂志 Nature 上呢？ 从时间线上进行分析，我们可以得知，1月11日病毒序列正式被公布（据我所知应该是中国CDC发布的），但是国外第一个提取出病毒毒株的时间却是到了2月26日，与序列的公布整整相差1个多月。我们也可以知道这次的Pandemic，一个多月可以新增多少感染者和死亡者，时间就是生命啊！而作者在序列公布后的第3天便下出了订单，在ICTV正式公布新冠病毒名称的第2天便得到了拯救完成的病毒。可以想象，如果以后没有可能及时得到病毒的毒株，我们可以直接根据序列得到病毒的毒株， 这是本篇文章最大的亮点之一，即在此类形势下给人一种研究病毒的范式。 第二个亮点，可以关注到作者不仅做了SARS-CoV-2，还做了MHV和MARS-CoV。看不明白的话给个提示：这三种病毒都是冠状病毒科（Coronaviridae ）的！此外，作者在表格中还列出未实现拯救的人呼吸道合胞病毒（hRSV-B）、寨卡病毒（ZIKA virus）和流感病毒（HCoV）。这意味着作者想 通过对一系列冠状病毒的拯救验证来说明这一平台广泛的适用性 ，将难缠的冠状病毒，乃至其他病毒的毒株获取难度降低。这或许对科学界是件好事，但是可能也是件坏事吧… Craig Ventor；冠状病毒亚基因组； 《COVID-19全景综述》，为一张大图，涉及基本信息，免疫学过程等内容， 很震撼且 非 常华丽 ！在 公众号“炫亦”回复“cv”即可获得云盘链接！ [1] Thao, et al.  Nature  , 2020.  [2] Natalay Kouprina & Vladimir Larionov.  Nat Protocol  , 2008. [3] Daniel G. Gibson, et al.  Science  , 2010.  [4] 孙明伟, 李寅, 高福.  生物工程学报  , 2010.