新冠论文参考文献

2064篇。打开中国知网官方网站，在搜索栏中输入新冠病毒，在显示的搜索结果中选择年份为2020年，可以看到结果总共有2064篇。中国知网，又被称为“中国期刊网”，是中国最大的学术论文数据库和学术电子资源集成商。该网站是由清华大学、清华同方发起，始创于1996年。国内将知识版权资源聚合在一起的平台还有万方、维普、超星等文献数据库检索平台。

参考文献主要是： Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects

标准的依赖Tn5的NGS试剂盒的很多试剂配方都是保密的，这样就很大程度上限制了应用的范围和大型project的实现。

作者提供了一种高效的Tn5生产及建库方案，简化部分步骤并对条件进行优化，使用简单的试剂实现了快速的有效的文库构建且可以应用到低至皮克级（这里作者巧妙使用了molecular crowding agents）的起始cDNA上（以scRNA-seq文库为例）

从头纯化的Tn5是未组装的，因此可以anneal我们想要的adaptor，从而扩大在单细胞领域、亚硫酸盐测序等的应用，而不是像很多试剂盒里都是组装好的Tn5（应用平台受限制）。

因为作者使用的纯化策略是含intein的Tn5，所以不同洗脱液有的是含intein的（Mxe-Tn5）有的则是intein被洗脱液成分切掉的

改变片段化反应的buffer：原来是Tris，但是它会随着温度的升高降低pH，不稳定

作者用的新buffer叫做TAPS:

同时，把转座反应体系由50ul降低到了20ul，转座后DNA的纯化也由原来的柱回收改成了直接用SDS和ddH2O

把Tn5从DNA上剥离下来。在在同一个管中实现tagmentation和PCR，不仅步骤简便，而且通量也提高了

因为PCR的聚合酶未知，所以作者测试了他们自己的酶的效果：

SDS用来stripping，有趣的是，PCR反应中72℃的gap filling其实足够将Tn5灭活了：

最优的stripping buffer中SDS浓度为2%

5ng的起始cDNA对in-house Tn5和commercial Tn5的建库效果进行测试，指标包括：

基因检出率，可重复性，准确性

1ng以上的cDNA建库可以就用作者的TAPS buffer：

但到pg级别的起始量，就需要用到molecular crowding agents：

其中，对于不同起始量的极少的cDNA，PEG的浓度和分子量都需要进行测试。PEG分子量越高，文库的产出量一般也高，说明PEG的确可以通过包裹水分子，使得Tn5的反应体系进一步减小，提高了反应效率

IPTG浓度：

裂解前菌体量：A600

超声裂解buffer组成：80 mL HEGX (20 mM HEPES-KOH at pH , M NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, Triton X-100)

裂解后离心获得的上清去除核酸背景：To the supernatant, mL 10% neutralized PEI

注意assembled-Tn5的浓度不是固定的，关键是Tn5在固定体系里的量是多少，可以测试不同浓度不同量的Tn5检测切割效果

转座反应温度是55℃

应用Tn5开发的基础是理解一些底层的机理，以及从具体应用里借鉴一些思想。我另外参考了几篇文章： High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution Tn5 as a model for understanding DNA transposition Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects Tn5 wikipedia 以及CUT-Tag Structure/function insights into Tn5transposition Insertion site preference of Mu, Tn5, and Tn7 transposons

思考转座酶可能的其他应用？

LIANTI

伊成器课题组聚焦新冠病毒共感染病原体的检测与研究（基于转座酶的TRACE）

另外转座酶还可以应用于构建稳转细胞株，比如： piggyBac系统