用pcr技术检测结核病的论文

基因是DNA分子上的一个功能片段，是遗传信息的基本单位，是决定一切生物物种最基本的因子;下面是我整理了基因检测技术论文，有兴趣的亲可以来阅读一下!

病毒基因的检测

【关键词】 病毒基因 检测

一 乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)测定

乙型肝炎是由乙肝病毒引起的以肝脏损害为主要临床特征的急、慢性传染病，严重者可 发展成慢性肝炎、肝硬化和肝癌。在我国，乙肝是危害人类健康的一种主要传染病。

【 参考值】

阴性 (Taqman荧光定量PCR技术)

【临床意义】

是乙型肝炎病毒感染的直接证据，是HBV有活性复制能力及具传染性的确切标志。

2.可定量检测HBV-DNA含量，为临床病情判断、疗效观察提供信息。

的出现先于其他血清学指标(如HBsAg)，可早期诊断HBV感染。

4.正常人HBV-DNA为阴性。当HBV-DNA为101～104拷贝/ml时，表明病毒复制水平低，传染性较弱;而当 HBV-DNA>104拷贝/ml时，表明病毒复制水平高，传染性强。

含量测定可为临床药物选择提供依据。

【注意事项】

1.标本可用血清或血浆，避免肝素抗凝，避免反复冻融。

2.标本室温放置不超过4小时。

3.溶血、高胆红素标本影响检测结果。

二 其他病毒DNA测定

(一)人乳头瘤病毒DNA(HPV-DNA)检查

人乳头瘤病毒是一种小的双链DNA病毒，根据核酸相关性分型已发现70余型。该病毒可以感染人的皮肤和黏摸上皮细胞，诱发细胞增生，产生乳头瘤样病变。

【参考值】

阴性 (多重核酸荧光定量PCR技术)

【临床意义】

难以用传统的病毒培养及血清学技术检测，目前主要采用分子生物技术检测HPV-DNA，灵敏度高。

2.可对尿道、阴道、宫颈脱落细胞进行人乳头瘤病毒的检测及分型，判断体内HPV感染状况。

6和11型与尖锐湿疣、喉头鳞状上皮乳头状瘤发生有关;HPV 16、18、31、32型等与宫颈癌发生相关。因此，可用于对HPV高危亚型的诊断，对尖锐湿疣、宫颈癌等疾病的诊断与筛查具有重要意义。

检测可用于考核疗效与预后。

【注意事项】

1.用无菌拭子取尿道、阴道、宫颈分泌物于无菌试管或无菌瓶中。

2.标本采集应严格按无菌操作，避免污染。并及时送检。

(二)人类巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA)检查

HCMV是疱疹病毒科成员，人类普遍易感，多为隐性或潜伏感染。在免疫功能低下、缺陷或抑制情况下，可发生成人HCMV感染，常呈弥漫性病变，严重者甚至死亡。

【参考值】

阴性 (荧光探针杂交PCR技术)

【临床意义】

1.用于临床HCMV感染的快速诊断。

2.用于临床免疫抑制 治疗过程中体内HCMV感染的快速诊断与疗效监测。获得性免疫缺陷综合征等患者HCMV感染的诊断与疗效监测。

技术检测HCMV的敏感性高，且HCMV-DNA的出现早于临床症状或血清学标记物的出现，可早期诊断 HCMV感染。

4.妊娠早期感染HCMV可引起胎儿先天畸形，产前检测HCMV-DNA有利于优生优育。

5.连续监测巨细胞病毒的含量变化可了解病毒的复制状况，从而为疾病的早期诊断与药物疗效提供直接的病原学依据。

【注意事项】

采用EDTA抗凝全血或脑脊液标本，采集后及时送检。

(三)单纯疱疹病毒DNA(simplex herpes virus， HSV-DNA)

单纯疱疹病毒是一种有囊膜的双股DNA病毒，分为I型和II型。近年来，HSV是性传播疾病、病毒性脑炎等疾病的重要病原体。

【参考值】

阴性 (荧光探针PCR技术)

【临床意义】

1.用于检测人血清样本或体液样本中的单纯疱疹病毒并可同时分型，辅助诊断HSV感染性疾病。

I型感染主要引起口唇疱疹、疱疹性结膜炎、脑炎和皮肤性疱疹，HSV II型主要引起生殖器疱疹， HSV-DNA检测可辅助诊断上述疾病，并可用于考核疗效与预后。 【注意事项】

1.血清用无菌注射针头抽取静脉血2ml于无菌肝功管中。

2.分泌物用无菌棉拭子采集标本，女性取宫颈或阴道分泌物，男性取精液或前列腺液，将取样后的棉拭子放入无菌试管或无菌瓶中。

3.脑脊液抽取脑脊液于无菌玻璃瓶中。

(四)EB病毒DNA(EB virus，EBV-DNA)

EBV属于丫疱疹病毒科，主要经涎液传播，PCR技术可灵敏地检测出标本中的EBV-DNA，满足临床诊断、 治疗需要。

【 参考值】

阴性 (荧光探针杂交PCR技术)

【临床意义】

1.可快速检测血液、脑脊液、组织、尿液中的EB病毒，为EB病毒感染提供直接证据。

病毒临床上与鼻咽癌传染性单核细胞增多症、霍奇金病等的发病密切相关。

【注意事项】

1.检测标本可采用EDTA抗凝全血、脑脊液、咽拭子、尿液、病变组织等。

2.标本采集时严格按无菌操作，并及时送检。

三 RNA病毒测定

丙型肝炎病毒RNA(HCV-RNA)检测

丙型肝炎病毒是一种单链正股RNA病毒，引起丙型病毒性肝炎。丙型病毒性肝炎多因输血或血制品而引起，在输血者中还存在无症状的HCV携带者。

【参考值】

阴性(RT-PCR，荧光定量PCR技术)

【临床意义】

1.有助于HCV感染的早期诊断。

阳性提示HCV复制活跃，传染性强。

转阴提示HCV复制受抑，预后较好。

4.连续观察HCV-RNA，结合抗-HCV的动态变化，可作为丙肝的预后判断和干扰素等药物疗效的评价指标。

【注意事项】

1.标本可用血清或血浆，用无菌注射针头抽取静脉血2～3ml于无菌肝功管或EDTA抗凝管中送检。避免肝素抗凝，避免反复冻融。

2.标本室温放置不超过4小时。

3.溶血、高胆红素标本影响检测结果。

参 考 文 献

[1]杨振,祁自柏,李河民.病毒基因检测技术的 发展趋势. 《 中国生物制品学杂志》,2006年01期.

[2]徐丽.利用基因工程进行PHB相关基因的克隆和烟草转化[D].山东师范大学,2000年.

点击下页还有更多>>>基因检测技术论文

必须各种百度

PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!

技术的研究进展

摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。

关键词 PCR技术;研究进展;应用

中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02

PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。

1 PCR技术原理

PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。

2 PCR技术的分类

在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。

实时荧光定量PCR技术

1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。

荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。

多重PCR技术

多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。

在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。

单分子PCR技术(SM-PCR)

单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。

单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。

3 PCR技术的应用

PCR技术在水产上的应用

基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。

PCR技术在微生物检测上的应用

1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。

4 展望

传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。

5 参考文献

[1] 常世敏.PCR在食品微生物检测中的应用[J].邯郸农业高等专科学校学报，2004，21(4)：23-25.

[2] 唐永凯，俞菊华，徐跑，等.实时荧光定量PCR技术及其在水产上的应用[J].中国农学通报，2010(21)：422-426.

[3] 吴学贵.LPS刺激点带石斑鱼免疫相关基因的克隆与组织表达差异性分析[D].海口：海南大学，2011.

[4] 侯立华，黄新，朱水芳，等.双色荧光多重PCR技术及在禽流感病毒检测中的应用[J].生物技术通报，2010(1)：168-172.

[5] 查锡良.生物化学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2009：483-485.

[6] 张杰道.生物化学实验技术PCR技术及应用[M].北京：科学出版社，2005：12-18.

[7] 谢海燕.黑线仓鼠LHR部分序列克隆及组织器官的表达差异[D].曲阜：曲阜师范大学，2011.

[8] KUBISTA M，ANDRADE J M，BENGTSSON M，et real-time pol-ymerase chain reaction[J].MoLecular Aspects of Medicine，2006，27(2-3)：95-125.

[9] AGINDOTAN B O，SHIEL P J，BERGER P detection of potato viruses，PLRV，PVA，PVX and PVY from dormant potato tubers by TaqMan real-timeRT-PCR[J].J Virol Methods，2007，142(1-2)：l-9.

[10] 李丽平.小麦慢锈品种叶片受条锈菌侵入后的木质素合成及调控研究[D].雅安：四川农业大学，2009.

[11] 薛霜，独军政，高闪电，等.实时荧光定量PCR技术研究进展及其在兽医学中的应用[J].中国农学通报，2010(7)：11-15.

[12] SCHUBERT J，FOMITCHEVA V，SZTANGRET-WISNIEWSKA J. Dif-ferentiation of Potato virus Y strains using improvedsets of diagnostic-PCR-primers [J].J Virol Methods，2007，140(1-2)：66-74.

[13] 袁继红.实时荧光定量PCR技术的实验研究[J].现代农业科技，2010(13)：20-22.

[14] 朱善元.生物检测技术PCR及其在兽医微生物检测中的应用[J].黑龙江畜牧兽医，1999(11)：21-22.

[15] 黄银花，胡晓湘，李宁，等.影响多重PCR扩增效果的因素[J].遗传，2003，25(1)：65-68.

[16] 陈诺，唐善虎，岑璐伽，等.多重PCR技术在食品微生物检测中的应用进展[J].生物技术，2010，37(10)：72-75.

[17] 刘连生.常规PCR技术与单分子PCR技术[J].医学信息，2010，23(11)：4379-4380.

[18] 顾超颖.汗孔角化病的临床分析，SSH1、ARPC3基因突变检测和表达谱分析[D].上海：复旦大学，2008.

[19] 唐永凯，俞菊华，刘波，等.翘嘴红鲌肝脏G6Pase催化亚基的克隆以及摄食和饲料中碳水化合物对其表达的影响[J].水产学报，2007，31(1)：45-53.

[20] 刘波，谢骏，苏永腾，等.高碳水化合物日粮对翘嘴红鲌生长、GK及GK mRNA表达的影响[J].水生生物学报，2008，32(1)：47-53.

[21] 俞菊华，戈贤平，唐永凯，等.碳水化合物、脂肪对翘嘴红鲌PEPCK基因表达的影响[J].水产学报，2007，31(3)：369-373.

[22] 孙淑娜，桂永浩，宋后燕，等.叶酸拮抗剂甲氨喋呤导致斑马鱼心脏发育异常及BMP2bHAS2表达下调[J].中国当代儿科杂志，2007，9(2)：159-163.

[23] SAWYER S J，GERSTNER K A，CALLARD PCR analysis of cytochrome P450 aromatase expression in zebrafish：gene specific tissue disyribution，sex differences，developmental programming，and estrogen regulation[J].General and comparative endocrinology，2006，147(2)：108-117.

[24] BEJ A K，MAHBUBANI M H，MILLER R，et PCR amplif-ication and immobilized capture probes for detection of bacterial patho-gens and indicators in water[J].Mol Cell Probes，1990，4(5)：353-365.

[25] ZHANG Z D，ALEXANDERSEN of carrier cattle and sheep persistently infected with foot-and-mouth disease virus by a rapid real-time RT-PCR assay[J].Journal of Virological Methods，2003，111(2)：95-100.

[26] ZHANG Z D，BASHIRUDDIN J analysis of foot-and-mouth disease virus RNA duration in tissues of experimentally infected pigs[J].TheVeterinary Journal，2009，180(1)：130-132.

[27] METZGER-BODDIEN C，BOSTEL A，KEHLE for analysis of food samples[J].J Food Prot，2004，67(8)：1585-1590.

点击下页还有更多>>>关于pcr技术论文