皮肤病相关综述论文

微生物环氧化物水解酶的研究与应用新进展 唐燕发 许建和 叶勤 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海 200237) 手性环氧化物及其开环产物邻二醇能与各种亲核试剂反应，因而在手性化合物的合成过程中被广泛应用，是一种重要的有价值的中间体。近年来很多研究小组都对它们的生产方法进行了研究[1]，如烯烃的Katsuki-Sharpless不对称环氧化和不对称二羟基化；烯烃的Jacobsen不对称环氧化。另一方面很多利用生物催化合成这类物质的方法已有报道，如水解酶类(特别是脂肪酶和酯酶), a-卤酸脱卤素酶，乳酸脱氢酶或甘油脱氢酶，单加氧酶，过氧化物酶和卤过氧化物酶。以上各种方法有的对底物有特殊要求，有的对映选择性不高，有的需要氧化还原辅酶如NAD(P)H，这些都限制了它们的应用。不依赖于辅因子的环氧化物水解酶[]可以有效地代替以上各种方法，环氧化物水解酶最初是在哺乳动物肝组织的解毒功能研究中被发现，但由于从哺乳动物中得到的这种酶来源有限，故限制了其大规模应用，但近年来发现在一些微生物如细菌、真菌中也存在环氧化物水解酶，有效地解决了这一问题。本文将综述各类细菌和真菌产生的环氧化物水解酶。 1 环氧化物水解酶作用机理 酶的一个天冬氨酸残基进攻被酶的一个赖氨酸残基部分质子化的环氧化物的一端形成一个共价结合的二元醇单酯-酶中间体[2,3]，酶的组氨酸残基[4]从落到酶活性中的一个水分子中夺取一质子从而产生一个羟基，这个羟基进攻二醇-单酯-酶中间体，水解产生二醇，如图1。 图1 环氧化物水解酶的作用机理 图2 环氧化物微生物水解时构型保持和构型反转 水解时有两个不同的途径，如图2。 (1) 羟基进攻取代较少的碳原子，手性中心构型不变(如by Asper- gillus niger)[5]。 (2) 羟基进攻取代较多的碳原子(即手性中心)从而使手性中心构型反转(如by B. sulfurescens)[5]。 在两种途径中，进入的羟基都是以反式立体方式进入的，若环氧环的两碳原子都是手性碳，则羟基进攻的任何位置碳原子的构型都将反转。虽然保持构型不变的第一种方式较普遍，但也有一些构型反转的例子已报道[5-7]。 2 细菌产生的环氧化物水解酶 早期美国Illinois大学等小组发现Pseudomonad sp. NRRL 2944[8]、Psedomonas pautida[9]、Bacillus megaterium ATCC 14581[10]中存在环氧化物水解酶，但真正开始对环氧化物水解酶的研究是由奥地利的K. Faber研究小组进行的。他们最初在用Rhodococcus sp. NOVO 409的固定化酶水解腈化合物的研究中发现该酶具有未知的能水解环氧化物的活性。对1,1-二取代环氧化物，当R1为甲基，R2为一长碳链时，对映选择性最高，剩余R-环氧化物和水解产物S-二醇ee值分别为72%和40%；对单取代环氧化物，ee值都很低；而内消旋环氧化物则不能作为底物[11]，如图3。 图3 Rhodococcus sp. NOVO 409不对称水解1,1-二取代环氧化物 之后他们[12]筛选了43种菌，其中7种显示活性，即4种细菌：Rhodococcus spp. NCIMB 11216, NCIMB11215 和NCIMB 11540及Corynebacterium sp. UPT 9；3种真菌：Diploida gossypina ATCC 10936, Fusarium solani DSM 62416 和Glomerella Cingulata ATCC 10534。其中第一和第四种细菌对2-环氧辛烷有中等活性，都优先水解R型环氧化物形成R-1,2-二羟基辛烷，但对映选择性很低。NCIMB11540水解2-甲基-1,2-环氧庚烷时产生的S-二醇和剩下的R-环氧化物ee值分别为89%和51%，E值为29。NCIMB 11216[13]水解2-甲基-1,2-环氧庚烷，2-甲基-1,2-环氧壬烷和2-甲基-1,2-环氧十一烷时，产物S-二醇ee值分别高达96%、98%和99%，剩下的R-环氧化物ee值亦分别为71%、25%和55%，E值分别为104、126和200，可见两个取代基差别愈大，选择性愈高，当把甲基改为乙基时，对映选择性E值急剧下降，其纯酶[14]表明该酶不需要辅酶，是一个溶解性的寡酶，分子量为35 kDa，等电点为。催化2-甲基-1,2-环氧庚烷时，最佳温度为30°C，最佳pH为，这个菌可运用于芳樟醇[15](一些植物和果实的香味物质)的合成中。 另有两种菌Rhodococcus equi IFO 3730和Mycobacterium paraffinicum NCIMB 10420[1]对1,1-二取代环氧化物也显示相似的对映选择性，E值大于200，其中第一个菌可应用于昆虫性信息激素(S)-(-)-Frantalin[16]的合成中，在拆分过程中E=39。 最近又发现另外4种菌，Nocardia sp. H8, Nocardia sp. EH1, Nocardia sp. TB1和Rhodococcus ruber DSM 43338[17]对2-甲基-1,2-环氧庚烷也具有很好的选择性(E>200)。以前的情况是若得到的二醇光学活性高，但转化率总是较低，使收率很低，并且剩下的环氧化物光学活性也很低，然而，两种新菌Nocardia sp. EH1和Nocardia sp. TB1对底物的转化率都达到50%，并且剩下的R-环氧化物和形成的S-二醇ee值都大于99%。在长侧链上引入一个芳香基团(即底物为4-苯基-2-甲基-1,2-环氧丁烷)则Nocardia菌对此底物的选择性急剧降低(EH1, E=12; TB1, E=13)。若酶水解后，再加酸处理，即两步反应在一起连续进行，则得到同一种构型的二醇[18,19]，收率都大于90%，ee值都大于99%。从Nocardia sp. EH1中提取的粗酶[20,21]水解顺式2,3-环氧庚烷，得到单一的产物(2R,3R)-2,3-二羟基庚烷，收率为79%，ee值为91%。两种异构体的水解都发生在分子中构型为S的碳原子上，故得到(2R,3R)-二醇这一种产物。此粗酶固定化[22]于DEAE-Cellulose后，酶的对映选择性只有很小的下降，但酶活提高了1倍多(为原来的225%)，最佳温度可从35°C提高到45°C，重复反应5次后，酶活仍有55%。纯化后得到的纯酶[23]表明该酶不需要辅酶,是一种寡酶，分子量为34kDa，最佳pH为8~9。 以上所研究的细菌酶都显示出相似的对映选择性，比如它们都优先水解S-2-甲基-1,2-环氧烷烃，Faber等还分离到了另外两种具有相反对映选择性的菌株，即Mycoplana rubra和"Rot" [24]，第二种菌在分类学上还没有确定。对1,1-二取代环氧化物都优先水解R型，但对映选择性都不高。 Faber所研究的环氧化物水解酶都属于组成型酶，它们对2-甲基-2-烷基环氧化物等具有分支的末端1,2-环氧化物具有很高的对映选择性，但对于无分支的末端1,2-环氧化物只有很低的对映选择性，并且不水解内消旋环氧化物，而南非Botes等[25]应用Chryseomonas luteola拆分1,2-环氧辛烷，剩余的S-环氧化物和形成的R-二醇ee值分别为98%和86%，这是到目前为止首次报道在细菌中存在的对末端1,2-环氧化物具有很高对映选择性的环氧化物水解酶。 1995年英国Carter 和Leak [26]分离到一株菌Corynebacterium sp. C12, 所产环氧化物水解酶为诱导型酶。Archer等[27]应用此菌拆分1-甲基-1,2-环己烯环氧化物，有很好的对映选择性，得到(1R,2S)环氧化物，(收率30%, ee>99%)和(1S,2S)-1-甲基-1,2-二羟基环己烷(收率42% , 89% ee)。若随后再用酸水解剩下的环氧化物，则两步串级反应就得到单一的(1S,2S)-二醇产物(收率80%, ee>95%)。这种诱导型酶的底物特异性范围较小，只对与诱导物相关的底物有相对较高的活性。分离得到的纯酶[28]表明该酶是一种聚合酶，其亚单位分子量为43140Da。 1989年荷兰Van den Wijingard等[29]从淡水沉淀物富集培养液中分离得到革兰氏阴性菌Pseudomonas sp. AD1，所产环氧化物水解酶也为诱导型酶。纯化[30,31]后表明该酶是一种寡酶，分子量是35kDa，该酶能水解表氯醇、表溴醇、环氧辛烷及苯乙烯环氧化物。基因克隆后在E. coli中表达[32]的重组酶水解苯乙烯环氧化物和对氯苯乙烯环氧化物[33]时对映选择性分别为和。Rink等[34]研究了其催化机理。除此之外，日本Nakamura等[35,36]发现在Corynebacterium sp. N-1074中存在两种环氧化物水解酶(IIa, IIb)也能降解表氯醇，其中酶IIb具有较高的对映选择性。 1999年荷兰Van Der Werf等报道[37]发现了一类新的产生于Rhodococcus erythropolis DCL 14的环氧化物水解酶。单萜能诱导该菌产酶，该酶是一种寡酶，分子量为17kDa，不需辅酶，在pH=7和50°C时酶活最高。只有柠檬烯-1,2-环氧化物，1-甲基-1,2-环己烯环氧化物，环己烯环氧化物和茚环氧化物可作为其底物。水解1-甲基-1,2-环己烯环氧化物时对映选择性同Corynebacterium sp. C12[27]相反，但两种情况下都得到(1S,2S)-二醇，说明该酶具有不同的催化机理。 从以上的综述可以看出，含有环氧化物水解酶的细菌比五六年前所认为的要普遍的多，这些细菌分别属于Pseudomonas, Rhodococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Mycoplana,“Rot”, Bacillus, Agrobacterium, Xanthobacter及Chryseomonas 等，其中Rhodococcus sp. NCIMB 11216, Nocardia sp. EH1 和Nocardia sp. TB1对2-甲基-2-烷基环氧化物等具有分支的末端1,2-环氧化物具有很高的对映选择性；Chryseomonas luteola对无分支的脂肪族末端1,2-环氧化物具有特别高的对映选择性。底物结构与酶的对映选择性的关系才刚被探讨，只有当底物具有严格的取代方式时，才具有高对映选择性。同单取代环氧化物相比，C-2位的甲基对对映选择性有重要的作用，然而，当甲基变为乙基后就丧失了对映选择性，这表明存在着一个相当严密的活性位点，只有一部分底物能符合它。大多数酶对被测试的底物显示相同程度的对映选择性，甚至对单取代和双取代环氧化物显示相似的对映选择性的变化，这些相似性表明这些酶在进化上是具有联系的。相信随着研究的深入，会有更多的有关这方面的研究报道。组成型酶对1,1-二取代环氧化物具有较高的对映选择性，但比活力都不高；而诱导型酶虽然比活力较高，但仅对有限的底物有活力。盼望在不久的将来可运用基因工程技术来解决这一问题。 3 真菌产生的环氧化物水解酶 虽然早期日本Suzuki等[38]和美国Kolattukudy[39]等发现真菌Helminthosporum sativum和Fusariun solani pis中存在环氧化物水解酶，但真正集中研究真菌环氧化物水解酶是由法国Furstoss等首先进行的。他们发现Aspergillus niger LCP 521能不对称水解香叶醇衍生物，制备Bower's compound[40](一种保幼激素类似物)；还可以选择性地水解非对映的8,9-环氧柠檬烯立体异构体，制备Bisabolol的4种天然立体异构体[41]。 1993年Furstoss等[5]报道了Aspergillus niger水解苯乙烯环氧化物剩下S-苯乙烯环氧化物(收率23%, 96% ee)，另一种菌Beauveria sulfurescens水解苯乙烯环氧化物具有良好的互补对映选择性，给出R-苯乙烯环氧化物(收率19%, 98% ee)，两种菌都产生同样的R-二醇，[18O]标记实验[42]结果表明A. niger水解发生于C-2，构型不变，而B. sulfurescens水解发生于C-1，构型反转。若在一个反应器中，同时用这两种菌水解苯乙烯环氧化物消旋物，则得到单一的二醇产物R-1-苯基-1,2-二羟基乙烷，收率92%，ee值为89%。在水解一系列取代苯乙烯环氧化物[43](底物结构如图4)时若苄位引入一个甲基如2就降低了A. niger的对映选择性，剩余S-环氧化物和R-二醇ee值分别为73%和32%；若在b位有取代如3-7，则都不能作为酶的底物。 图4 与A. niger 和 B. sulfurescens 反应的底物 B. sulfurescens水解a -甲基苯乙烯环氧化物2时对映选择性不高；水解顺式-b -甲基苯乙烯环氧化物3形成的(1R,2R)-二醇在所有转化率下几乎都光学纯，而剩下的(1R,2S)-环氧化物在所有转化率下ee值都很低(20%)；b ,b -二甲基苯乙烯环氧化物5不能作为B. sulfurescens的底物；水解茚环氧化物6和1,2-环氧四氢奈7后剩余的(1R,2S)- 环氧化物光学纯度很高(ee>98%)；水解反式-b -甲基苯乙烯环氧化物4产生的(1R,2R)-环氧化物和(1R,2S)-二醇收率(分别为30%和38%)和ee值(分别为98%和90%)都很好，它是唯一在转化率接近50%时，剩余的环氧化物和二醇产物光学纯度都很高的底物，但反式-环氧化物的对映选择性水解在文献中少有报道。 对一系列对位取代苯乙烯环氧化物[44]，A. niger都仍优先水解R-环氧化物形成R-二醇，剩余S-环氧化物ee值都大于96%，收率28%~38%。水解对硝基苯乙烯环氧化物时，若随后进行酸水解[45]，则得到单一的R-二醇(收率94%, 80% ee)，可用于制备b-肾上腺素阻断剂(R)-Nifenalol。酶水解时，若用粗酶[46,47]代替菌丝体，DMSO是抑制影响最小的一种助溶剂，反应后剩下的S-环氧化物ee值可达97%，转化率为47%，对映选择性也很高(E=41)，底物浓度可提高到330mmol/L()而不影响ee值，因此这个方法在制备规模的环氧化物拆分上很有用。B. sulfurescens仍显示互补的对映选择性，当取代基是-H, -CH3, -F, -Br时，水解剩余的R-环氧化物ee值都大于96%，除对硝基苯乙烯环氧化物外，水解所形成的二醇仍都具有R构型，给电子基团如p-CH3，使反应速度增加4倍，而吸电子基团不仅降低反应速率还降低对映选择性，这两种现象都显示有酸催化过程存在，并且在过渡态时有碳正离子存在。

医师是我的美容师到医院接受一些美容治疗，已经在消费者间广为流行 ，像是果酸换肤、美白导入甚至是护肤做脸，让皮肤美容医学成为近几年最红的显学。 到医院接受一些美容治疗，已经在消费者间广为流行 ，像是果酸换肤、美白导入甚至是护肤做脸，让皮肤美容医学成为近几年最红的显学。 医师大举介入美容市场，标榜结合医疗专业的医学美容中心也像是雨后春笋在医院、诊所间不断的开张。医师大举介入美容市场，标榜结合医疗专业的医学美容中心也像是雨后春笋在医院、诊所间不断的开张。以往的观念认为皮肤科医师应该专职於疾病的治疗，美容保养则是属於美容师的工作，医师往往著重於开药、治病，对於美容保养却视为畏途。以往的观念认为皮肤科医师应该专职于疾病的治疗，美容保养则是属于美容师的工作，医师往往着重于开药、治病，对于美容保养却视为畏途。 国内对於正规美容医学的萌芽，开始於皮肤科教授吴英俊医师等人的投入，有鉴於不正确的护肤美容的观念，对皮肤的健康会造成更严重伤害， 皮肤科医师在专注於一般皮肤病的治疗之外，也开始肩负起教育民众正确的护肤观念，并监督美容护理行为的施行。国内对于正规美容医学的萌芽，开始于皮肤科教授吴英俊医师等人的投入，有鉴于不正确的护肤美容的观念，对皮肤的健康会造成更严重伤害， 皮肤科医师在专注于一般皮肤病的治疗之外，也开始肩负起教育民众正确的护肤观念，并监督美容护理行为的施行。 由於皮肤科医师的积极介入，对国内的皮肤保健、防晒观念、皮肤癌检测都有很重大的贡献。由于皮肤科医师的积极介入，对国内的皮肤保健、防晒观念、皮肤癌检测都有很重大的贡献。美容医学已经成为极端专业的行为 美容医学已经成为极端专业的行为随著美容科学进步突飞猛进，新的治疗技术及保养成分不断被开发出来，许多打著医学美容旗帜的商品纷纷问市，常常带给消费者无所适从的无力感。随着美容科学进步突飞猛进，新的治疗技术及保养成分不断被开发出来，许多打着医学美容旗帜的商品纷纷问市，常常带给消费者无所适从的无力感。 医学美容市场蓬勃发展，但是百家争鸣竞争激烈，厂商、医师、美容师都想分食大饼，但是各个单位的做法及专业程度差异非常大，相对的消费者产生不良反应的机会也相形提高。医学美容市场蓬勃发展，但是百家争鸣竞争激烈，厂商、医师、美容师都想分食大饼，但是各个单位的做法及专业程度差异非常大，相对的消费者产生不良反应的机会也相形提高。 医疗人员如何在商业利益与医疗专业当中拿捏分寸，如何处理不良反应，也成为从事医学美容的挑战。 医疗人员如何在商业利益与医疗专业当中拿捏分寸，如何处理不良反应，也成为从事医学美容的挑战。医师方面必须随时注意美容科技不断的成长，提供消费者最新及正确的资讯，并积极整合药师、美容师、护理治疗人员，透过分工合作提供消费者更完善安全的美容服务。医师方面必须随时注意美容科技不断的成长，提供消费者最新及正确的资讯，并积极整合药师、美容师、护理治疗人员，透过分工合作提供消费者更完善安全的美容服务。 消费者也必须认清医学美容是极端专业的行为，需要寻找有职业证照合格的专业人士，接受美容治疗才能有所保障。消费者也必须认清医学美容是极端专业的行为，需要寻找有职业证照合格的专业人士，接受美容治疗才能有所保障。皮肤美容医学的范畴 皮肤美容医学的范畴1.肌肤检测与美容保养谘询： 1.肌肤检测与美容保养咨询：皮肤科医师的角色，在於拥有专业的临床医学背景，除了提供病患在皮肤疾病的治疗之外，更进一步检测消费者的皮肤性质，指导消费者正确的使用合适的用品。皮肤科医师的角色，在于拥有专业的临床医学背景，除了提供病患在皮肤疾病的治疗之外，更进一步检测消费者的皮肤性质，指导消费者正确的使用合适的用品。 在接触性皮肤炎的病例中的病例是由美容保养品引起，这与个人的体质、皮肤的含水量、含脂量及酸碱度有关，所以医师需要按照个别肌肤状况给予适当的保养建议。在接触性皮肤炎的病例中的病例是由美容保养品引起，这与个人的体质、皮肤的含水量、含脂量及酸碱度有关，所以医师需要按照个别肌肤状况给予适当的保养建议。对於保养品，皮肤科医师所关切的是产品的成份组成，产品的实验测试及产品制造过程，其安全性、过敏性、致粉刺性。对于保养品，皮肤科医师所关切的是产品的成份组成，产品的实验测试及产品制造过程，其安全性、过敏性、致粉刺性。 以公正及客观的立场，提供消费者有关美容保养品的资讯，对消费者具有保护和教育的功能。以公正及客观的立场，提供消费者有关美容保养品的资讯，对消费者具有保护和教育的功能。2.医疗保养品的使用及开发 2.医疗保养品的使用及开发居家使用的医疗保养产品是医学美容的一个重要项目，医疗保养品的作用明确，产品成分、浓度、作用机制都有医学的验证，也有详细明确的医疗专业的使用建议，所以逐渐受到消费者的欢迎青睐。居家使用的医疗保养产品是医学美容的一个重要项目，医疗保养品的作用明确，产品成分、浓度、作用机制都有医学的验证，也有详细明确的医疗专业的使用建议，所以逐渐受到消费者的欢迎青睐。 主要分为主要分为(1)功能活化，像是高浓度的维他命C、果酸、抗氧化剂等保养品。 (1)功能活化，像是高浓度的维他命C、果酸、抗氧化剂等保养品。(2)修护保养，过敏性肤质或异位性皮肤炎患者使用的温和清洁、保养品。 (2)修护保养，过敏性肤质或异位性皮肤炎患者使用的温和清洁、保养品。(3)术后护理，磨皮、手术或换肤后适用的修护、防晒、美白或遮瑕保养品。 (3)术后护理，磨皮、手术或换肤后适用的修护、防晒、美白或遮瑕保养品。(4)辅助医疗，抗皮脂、抑制痤疮、抗霉菌产品。 (4)辅助医疗，抗皮脂、抑制痤疮、抗霉菌产品。 医疗用保养品的出现，填补了药品与化妆品的空间，因为介於两者之间，所以又被称为" 药妆品 。 医疗用保养品的出现，填补了药品与化妆品的空间，因为介于两者之间，所以又被称为" 药妆品 。3.特殊美容治疗 3.特殊美容治疗无论美白、战痘、除斑或是抗老化，都不是一蹴可几，甚至无法依靠涂抹一般保养品来达成。无论美白、战痘、除斑或是抗老化，都不是一蹴可几，甚至无法依靠涂抹一般保养品来达成。 有赖於科技的进步，一些医学美容护肤，及处理特殊皮肤问题的保养方式，逐渐被开发推广。有赖于科技的进步，一些医学美容护肤，及处理特殊皮肤问题的保养方式，逐渐被开发推广。 譬如果酸换肤、左旋维他命C导入、微晶磨皮、青春痘调理，由於有医院做后盾，有意尝试的民众还不少。譬如果酸换肤、左旋维他命C导入、微晶磨皮、青春痘调理，由于有医院做后盾，有意尝试的民众还不少。 但是消费者究竟要接受什麼治疗、疗程要多久、平时的保养要注意什麼、要不要配合使用居家护理产品……都应先有了解。但是消费者究竟要接受什么治疗、疗程要多久、平时的保养要注意什么、要不要配合使用居家护理产品……都应先有了解。 常见的医学美容治疗 果酸换肤术 、 左旋维他命C导入 、 微晶磨皮 常见的医学美容治疗 果酸换肤术 、 左旋维他命C导入 、 微晶磨皮

皮肤性病科护理教学的几点体会 皮肤护理课包括的专业理论知识多，专业操作技能广泛，学院 非常重视基础护理和临床护理教学，所以要上好一堂生动的、高质量 的皮肤护理课，教师的教学方法是关键。 皮肤科患者由于某些疾病病程较长，影响病人的生活质量，病 人心理压力较大，且疾病表现在外，视觉上难以被旁人接受，更增加 了病人的心理负担，在皮肤护理教学中，学生往往有怕脏、怕传染的 心理而影响其学习的积极性， 故在临床护理教学中既要让护理学生学 好皮肤病的基础理论， 又要做好病人的基础护理， 使病人舒适的同时， 也要注重与病人的交流，缓解病人的心理压力，放松心情接受治疗， 促进疾病的痊愈。现将皮肤科护理教学体会总结如下。 1 培养和激发护理学生学习的兴趣 由于皮肤病总论概念性强，内容较单调。皮肤科外用药物多种 多样，为提高学生学习热情，带教时笔者将本科内容与日常生活紧密 联系起来，以此来调动学生的积极性。例如，在给学生展示外用药物 实物剂型时，先给学生观看美容霜、防晒霜、珍珠霜等，然后讲解其 组成、作用、适应证、用法及注意事项。在学习外用药物的剂型时， 先给学生拿一瓶水——溶液剂型，一袋炉甘石粉——粉剂，然后将炉 甘石粉倒入水中，形成洗剂，形象、生动地帮助学生记忆，从而激发 了学生的学习兴趣。皮肤专科护理操作较多，如湿敷、封包、封闭及 对创面处理等，应给予更多的耐心和讲解，可在操作示范后让护生从 简单到复杂操作[1-2]，鼓励护生将自己所学知识运用到临床，自己先 寻找护理的方法。这样不但加深对皮肤科护理知识的理解，同时又能 有机地复习已学过的有关知识，使学习气氛活跃。 2 选课教学，教学相长 教学过程包括教和学两个方面，是教和学的辨证统一。 传统的临床医学教学模式强调以传授知识、 经验和技能为目的， 有利于教师把握教学方向，突出重点，其优点是很明显的，但也存在 不少缺陷，如教学方法过死，教师授课中存在知识的灌输，这种灌输 式教学方式容易养成学生仅仅接受现成知识，被动学习的习惯。如此 培养出来的医学生可能基础理论和基本技能较好， 而创新精神和创造 能力不足，缺乏临床应对问题、解决问题的能力。而皮肤护理的学生 在实际的临床工作中要不断面对各种皮损， 甚至是几种皮损集中在同 一个体身上，学生能否运用所学知识正确分析解决问题.如果不能学 生就没有积极性，就很难达到预期的目的。实践证明，根据教学大纲 和教学内容,选几节课，让学生讲讲，设置一定的情景,以直观、形象、 生动的方式,使学生融入到特定的情景中去,引导学生参与教学的全过 程，加深护生对系统理论的深刻理解和对实际操作的感性认识,设身 处地地思考问题,解决问题[3]。这样做不仅使讲课学生得到了锻炼， 其他同学听起来亲切、 可信， 而且学生的讲课方法对教师也很有启发， 有利于教师改进教法。 3 充分利用多种教学方法 在皮肤性病学授课过程中充满了大量形态的描述，许多皮肤病 难以用语言、文字描述清楚。而皮肤性病中绝大多数疾病都有比较特 异的皮损，皮损的性质、形态、分布、排列是疾病诊断的重要依据， 所以对皮损的掌握就显得尤为重要。因此。笔者合理安排教时间，尽 量在讲完典型临床表现之后， 即时给学生观看典型皮疹的图谱或者是 电视录像、幻灯片等，然后根据典型临床表现导出该病护理要点。例 如。天疱疮的患者可能有水疱、脓疱、糜烂、渗出、结痂等多种皮损， 讲完后利用 3～5 分钟导入病例，请学生分析后说出其护理诊断和护 理要点。由理论联系实际，学生学习热情高涨，发言积极，最后由教 师总结、矫正。 4 注重沟通技巧与合作能力的培养 随着现代护理学的发展，护理模式由“以疾病为中心”的功能 护理模式发展为“以病人为中心”的整体护理模式，护理服务对象不 仅包括病人，还包括健康人群。新的护理模式对现代护理的教育手段 和教育方法提出了更新、更高的要求[4]。要取得患者的信任和配合， 掌握沟通技巧，加强心理护理，体现人文关怀，才能收集第一手的临 床病例资料，这光靠良好的服务是不够的，因此要教会护生如何与患 者进行沟通，例如：在进行荨麻疹病例分析时，强调除了要告知患者 不要进食鱼、虾、蛋等过敏食物，还应与家属交往、沟通，不予患者 进食该类食物，避免一切可疑的诱发因素；面对病情比较特殊的如性 病患者，要事先准备好良好的沟通环境，在尽量没有第三者在场的情 况下进行沟通，解除思想顾虑，告诉患者要将病情如实告知医务人员 才能尽快治愈疾病，告知性伴侣应禁止性生活、注意隔离污染物。在 取得患者信任以后，对患者进行健康教育，指导患者生活注意事项， 使患者坚持治疗，取得事半功倍的效果[5]。 参考文献： [1] 石 英 . 提 高 护 生 临 床 教 学 质 量 之 我 见 [J]. 局 解 手 术 学 杂 志,2003,12(1):6-7 .[2]林雪峰,刘凤琴.皮肤科护理带教模式的改革初探[J].哈尔滨 医药,2002,22(5):97. [3]王长远,秦俭,王晶,孙长怡.情景教学法在急诊心肺复苏教学 中的应用[J].实用预防医学,2007,6(3):927-928. [4]张瑞莹,孙亚男,刘君,等.在《基础护理学》教学中运用任务驱 动教学法的方法探究[J].中华护理教育,2008,5(3):109-110. [5] 孙 晓 英 . 皮 肤 科 护 理 带 教 方 法 探 讨 [J]. 卫 生 职 业 教 育,2004,19:139.

腐乳是我国独具民族特色的大豆发酵食品,具有独特的风味,蛋白质含量极其丰富,是一种质构颇似软干酪的植物蛋白食品.腐乳生产过程中色、香、味、体的形成都与微生物的作用密切相关.本文概述了腐乳生产用主要出发菌株产蛋白酶的酶学性质,并综述了微生物蛋白酶在腐乳生产中的应用研究进展.

1 蛋白酶的生物学特点 蛋白酶是微生物产生的一类具有蛋白水解活性的酶，许多皮肤真菌可分泌蛋白酶，如须癣毛癣菌、红色毛癣菌、鸡禽毛癣菌、石膏样小孢子菌、犬小孢子菌、新霉素链霉菌、密旋链霉菌、短帚霉、黄曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌等。一些细菌也可产生蛋白酶，如栖息微球菌、表皮葡萄球菌和地衣芽孢杆菌等。Lucas FS等[1]在对牧场土壤产蛋白酶细菌分离中发现产蛋白酶细菌具有多样性，可为杆菌属、噬细胞菌属、放线菌属或蛋白菌属（Proteobacteria）。最近，Kim JS [2]发现一种新的细菌Fervidobacterium pennivorans 能够产生称为fervidolysin的角蛋白酶。Riffel A等[3]从家禽废物中分离出一种新的能完全降解羽毛的产蛋白酶的细菌，经形态、生化及16S rRNA鉴定为Chryseobacterium sp菌株 kr6。蛋白酶来源不同，其结构、理化性质、活性和底物也不同。这些酶多数属于细胞外酶，个别为细胞内酶。根据蛋白酶反应的最适pH值不同可以把蛋白酶分成酸性酶和碱性酶二大类；多数蛋白酶反应的最适温度在45℃～50℃，而念珠菌酸性蛋白酶（CAP）的最适温度为37℃。多数酶的活性表达依赖低浓度二价金属离子（Ca2+、Mg2+等），而一些重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+等）、1,10-邻二氮杂菲和EDTA则抑制其活性[3，4]。不同的蛋白酶有不同的特异性抑制剂，分别属于不同酶家族的抑制剂，提示蛋白酶具有不同的进化起源。蛋白酶的产生需要底物的诱导，如用蛋白胨培养的犬小孢子菌不产生蛋白酶，但在培养基中加入人发后，则可以产生蛋白酶。蛋白酶的底物范围相当广泛，除蛋白外，还包括多种多肽、胶原蛋白、酪蛋白、弹性蛋白、血红蛋白、明胶和卵蛋白等。但一些蛋白酶底物范围却较窄，如鸡禽毛癣菌酶只能利用鸟类羽毛，因此，它只感染鸟类。而密旋链霉菌释放的丝氨酸蛋白酶，P1位点对底物的精氨酸和赖氨酸有专一性，而P1'位点对苯丙氨酸和精氨酸有专一性。该酶对底物表现出高度的立体选择性和二级结构专一性[5]。蛋白酶反应的水解产物因蛋白酶的不同而不同，须癣毛癣菌蛋白酶I的水解产物是氨基酸，颗粒发癣菌蛋白酶则是短肽。 2 蛋白酶与免疫 蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子，是研究真菌疫苗的一个候选抗原，能否利用蛋白酶作为疫苗来预防动物和人的皮肤真菌感染一直是人们关注的问题，因此，研究蛋白酶与宿主免疫的相互关系非常重要。Descamps F等[6]认为针对真菌抗原的循环抗体与皮肤真菌感染的易感性及疾病的恢复无明显的关系，与体液免疫不同，细胞免疫反应与皮肤真菌感染的康复及抗病性的获得密切相关，针对真菌抗原的迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity，DTH)与皮损的恢复以及防止复发密切相关，缺乏DTH则与真菌的易感性和慢性感染相关。将真菌感染鼠的Th细胞转移至易感鼠可获得过继免疫，也说明了细胞免疫反应在真菌感染中的重要性。Mignon BR等[7]最早观察了天然的犬小孢子菌外抗原和纯化的重组犬小孢子菌蛋白酶对豚鼠犬小孢子菌实验感染模型体液免疫和细胞免疫反应的影响，发现纯化的蛋白酶并不诱导豚鼠产生抗蛋白酶IgG，蛋白酶不引发或仅引发微弱的DTH，提示蛋白酶不是犬小孢子菌感染的重要抗原。Brouta F等[8]用ELISA法和淋巴细胞增殖分析方法观察了天然的犬小孢子菌外抗原和纯化的重组蛋白水解金属蛋白酶(recombinant keratinolytic metalloprotease，r-MEP3)对豚鼠犬小孢子菌实验感染模型体液免疫和细胞免疫的影响，发现外抗原和r-MEP3均可促进豚鼠的体液免疫和细胞免疫。Woodfolk JA等[9]也发现重组红色毛癣菌蛋白酶Tri r2激发速发型超敏反应和DTH，认为对真菌特异性抗原的低反应性是造成人类真菌感染的原因。 Descamps F等[10]用纯化的重组犬小孢子菌 kDa蛋白酶和天然的犬小孢子菌外抗原作为疫苗免疫豚鼠，并观察其对豚鼠犬小孢子菌实验感染模型的作用。结果发现蛋白酶和外抗原均可引起强烈的体液免疫和细胞免疫反应，但反映皮损严重程度的评分与对照组之间无显著差异。说明犬小孢子菌蛋白酶诱导的特异性免疫反应不能对犬小孢子菌的感染起保护作用。因此，在利用蛋白酶研制真菌疫苗的道路上仍然面临着诸多困难。 3 蛋白酶与皮肤病的治疗 蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子，因此，能否利用蛋白酶抑制剂或者蛋白酶单克隆抗体抑制蛋白酶的作用，削弱皮肤真菌的侵袭性，从而达到治疗皮肤真菌感染的目的，是今后研究蛋白酶与皮肤真菌感染相互关系的一个重要方向[11]。迄今为止，尚缺乏研制蛋白酶单克隆抗体在体表中和蛋白酶削弱皮肤真菌的侵袭性报道。蛋白酶具有高效的蛋白水解活性，利用蛋白酶改善药物在蛋白中的通透性，提高皮肤外用药物的疗效，特别是在银屑病、角化过度性皮肤病（神经性皮炎、慢性湿疹等）和甲病中的治疗应用值得研究。蛋白酶也可以应用于美容护肤品，帮助活性因子透过皮肤屏障，去除皮肤多余角质，实现皮肤的深层护理。角蛋白酶能水解毛发蛋白，利用蛋白酶进行脱毛，治疗多毛症也可能具有良好的应用前景。4 基因工程蛋白酶的研究 以往对蛋白酶的研究工作主要集中于菌种筛选、酶的提取纯化和活力测定等基础工作，对酶结构和基因表达的研究极少。20世纪90年代，随着分子生物学技术的发展，国外的一些学者开始进行蛋白酶基因工程表达和分子结构等方面的研究。Lin X等采用随机引物PCR的方法获得了编码地衣芽孢杆菌PWD-1菌株分泌的蛋白酶基因（Ker A）的全序列，Ker A基因与地衣芽孢杆菌NCIMB6816编码Carlsberg枯草杆菌蛋白酶的基因具有97％的同源序列。将Ker A基因转染产酶缺陷型枯草杆菌DB104菌株，该转化菌株能在含羽毛的培养基和LB培养基中产生活性蛋白酶[14～16]。Woodfolk JA等从红色毛癣菌cDNA文库克隆了Tri r4，并在毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达了重组蛋白Tri r4，一个含726个氨基酸的蛋白质，属丝氨酸蛋白酶家族。另外，还在埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）菌株BL21中表达和发现了Tri r2，一种毛癣菌的新抗原，编码412个氨基酸，属D类枯草杆菌蛋白酶亚家族；通过SYBYL分子模建软件包进行分子模建，明确了Tri r2的三维分子结构和免疫优势T细胞抗原决定簇的分子位点[9,17，18]。2002年，Descamps F等[19]成功地从犬小孢子菌中获得了3个具有蛋白水解活性的枯草杆菌蛋白酶的基因全序列，并通过毕赤酵母系统重组表达了SUB3蛋白酶[6]。Wang JJ 等[20]用枯草杆菌表达系统和埃希氏大肠杆菌系统表达了蛋白酶—链亲和素融合蛋白，并用生物素—亲和素一步法纯化了融合蛋白，提高了纯化效率和蛋白酶的稳定性。上述研究为蛋白酶的工业化生产与应用提供了良好的工作基础。由于微生物在底物诱导状态下表达蛋白酶，而在非底物诱导状态下不表达蛋白酶，因此，差异PCR等方法不失为发现蛋白酶新基因的良好手段。 综上所述，蛋白酶作为皮肤真菌重要的侵袭因子，一方面，在皮肤真菌感染的发病中起重要作用；另一方面，蛋白酶具有高效的蛋白水解活性，其在生物医药、美容、废物处理及动物饲料生产等方面具有广阔的应用前景。