随着饮食结构和生活习惯的改变，肥胖及代谢综合征的流行，非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatcHepatitis，NASH)的发病率呈日渐升高趋势， 成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，在某些地区甚至超过病毒性肝炎。目前西药疗效并不十分理 想，中医药在治疗NASH方面的疗效日益受到重 视。本研究通过观察丹参注射液对NASH大鼠肝 组织NF-kB、TNF-a表达的影响，探讨丹参防治 NASH的可能作用途径，为治疗NASH筛选有效 药物提供实验依据。
1材料与方法
1.1实验动物45只SD雄性大鼠购自中山大学动物实验中心大鼠于清洁动物室饲养，普通饲料喂养，自由饮水。
1. 2造模方法45只SD大鼠随机分为4组：正常组、模型组、 丹参治疗组和西药对照组，除正常组大鼠正常饮食 外，其余各组大鼠均采用高脂饲料喂养：普通鼠饲料 基础上加2%胆固醇和13%猪油，分笼饲养，自由摄 食与饮水，每日更换饲料和水1次，饲养16周。 NASH造模标准参照范建高等的方法[1]。
1. 3给药方法西药对照组每天予还原型谷光甘肽钠溶液， 10 ml/kg腹腔注射，丹参治疗组大鼠每天予丹参注 射液，m/kg腹腔注射（丹参治疗量及谷胱甘肽钠 治疗量均相当于成人用量的20倍），正常组和模型 组予等量生理盐水腹腔注射，连续16周。
1.4检测项目及方法
1.4. 1免疫组织化学检测肝组织TNF-a表达按 照SP免疫组织化学试剂盒说明书进行免疫组织化 学检测，用已知阳性片作为阳性对照，PBS缓冲液 取代一抗作为阴性对照。TNF-a蛋白阳性表达表 现为细胞质呈棕褐或棕黄色，选择多个具有代表性 的高倍视野，采用IPP软件计算平均光密度值。试 剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
1. 4. 2 电泳迁移率改变分析检测大鼠肝组织NF- kB 活性参照核心试剂盒说明书，按下列顺序操 作：①提取并定量核蛋白探针标记纯化；^4%非 变性聚丙烯酰胺凝胶配制结合反应；©0. 5 X TBE电泳液，予恒压180 V电泳90 min;⑥剥离胶 片，电灯烤干，磷屏曝光20 h;⑦应用图像分析软件 BandScan 5. 0 对所形成的特异性产物条带计算积 分光密度分析，以丹参组与正常对照组的结合条带 的IA比值表示丹参治疗组的相对结合活性。试剂 盒购自上海碧云天生物技术公司。
1.5取材造模第16周末，各组大鼠禁食不禁水12 h，予 2%戊巴比妥钠麻醉后沿腹中线开腹，快速取出肝 脏，检测相关指标。
1.6统计学处理采用SPSS14 0软件进行统计学处理，计量资 料以无士s表示，P〈0. 05为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1肝组织免疫组织化学TNF-a的表达TNF-a主要表达于细胞浆，着色为棕褐色或棕 黄色。正常肝组织中着色很淡，几乎不表达。模型 组TNF-a阳性表达较正常组明显增强（P〈0. 01)， 与模型组比，丹参治疗组TNF-a表达明显减低（P〈0. 01)。见表 1。
2.2 EMSA检测各组肝组织NF-kB活性通过EMSA实验发现，模型组肝组织NF-kB 较正常组明显升高（P〈0. 01)，丹参干预后肝组织 NF-kB明显降低（P〈0. 01)。见图1、2。
图2各组与正常组的NF-kB特异结合的条带IA比值
３ 讨论
非酒精性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）是一种遗传－环境－代谢应激相关性肝病，其发病机制非常复杂，目前尚未完全明确。Ｄａｙ等提出的“二次打击”学说以脂质代谢异常、细胞因子、氧化应激、脂质过氧化被广泛接受［２－３］。中医学无ＮＡＳＨ 这一病名，根据其症状及临床特点，将其归为“胁痛”、“积聚”、“痞满”、“痰证”、“湿阻”等范畴。该病最早记载于《难经》：“肝之积，名曰肥气。”故也称肥气病，指体内过多肥脂之气蓄积于肝脏。中医认为ＮＡＳＨ 形成外因是嗜食肥甘厚味，内因是肝胆疏泄失常，脾失健运，导致气滞痰阻，久而成瘀，痰瘀互结而成。现代药理研究已经证实丹参具有促进脂质代谢，抗脂质过氧化、清除自由基、抑制氧化应激，减轻肝细胞变性坏死，促进肝细胞再生等作用。
ＮＦ－κＢ是一种前炎性递质基因核因子，通过调控基因转录来调控炎症反应、免疫应激反应、细胞黏附及凋亡，特别在表达炎症基因中占有枢纽性位置［７－８］。ＴＮＦ－α是ＮＡＳＨ 发病的独立危险因素，在单纯性脂肪肝转化为ＮＡＳＨ 过程中起着关键作用［９－１０］。研究表明，ＴＮＦ－α与胰岛素抵抗密切相关［１１－１２］，并通过减少外周组织脂肪分解，促进肝细胞甘油三酯合成与聚集，而引起脂质在肝组织异常蓄积［１３－１４］。ＴＮＦ－α通过激活ＩＫＢ激酶β（ＩＫＫβ）使Ｉκβ降解，从而活化Ｎ Ｆ－κＢ，ＮＦ－κＢ活化后即启动多种促炎因子基因，如ＴＮＦ－α、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、黏附因子、趋化因子等转录，这些细胞因子不仅可以直接诱导肝细胞炎症损伤，还趋化炎性细胞迁移，放大炎症反应，共同参与肝组织炎症、肝纤维化等病理生理过程［１５－１８］。除调控与炎症反应相关基因外，ＮＦ－κＢ还通过活化凋亡基因ｃ－ｍｙｃ及凋亡相关因子Ｆａｓ，引发Ｃａｓｐａｓｅ家族Ｃａｓｐａｓｅ－８及下游Ｃａｓｐａｓｅ－３活化，形成级联反应导致肝细胞凋亡，并趋化中性粒细胞形成“瀑布式”炎症反应［２０］，反过来，炎症又能进一步活化肝细胞凋亡途径，形成恶性循环。
笔者前期研究以高脂饮食成功复制了ＮＡＳＨ大鼠模型，丹参干预治疗后能改善ＮＡＳＨ 大鼠肝功能及脂质代谢异常，减轻肝组织炎症。本实验结果表明模型组大鼠肝组织ＮＦ－κＢ表达增强，伴随ＴＮＦ－α水平增高，提示ＮＦ－κＢ及ＴＮＦ－α活性升高在ＮＡＳＨ的发生发展中起关键作用，与既往研究一致［２２］，丹参干预治疗后大鼠脂质代谢紊乱改善，肝组织炎症减轻，ＮＦ－κＢ及ＴＮＦ－α表达随着降低。综上，丹参干预能改善ＮＡＳＨ 的炎症状态：一方面丹参通过抑制ＮＦ－κＢ的表达及活化，减少多种促炎因子基因转录，降低ＮＡＳＨ 炎症相关因子ＴＮＦ－α及其他炎性递质的释放，减轻氧化应激及细胞因子损伤；另一方面丹参可多方面调节脂代谢，减少肝脏脂质的沉积，改善肝功能及ＮＡＳＨ 脂代谢紊乱，从而有效防治ＮＡＳＨ 的发生发展。
