【摘要】 目的 探讨补肾调经中药对多囊卵巢综合征(pcos)患者促排卵后子宫内膜整合素β3(integrinβ3)表达的影响。方法 将无排卵pcos患者36例随机分为2组,给予不同的促排卵方案：a组为克罗米芬(cc)/绒毛膜促性腺激素(hcg)组,共17例;b组为cc/hcg加中药组,共19例。同期选择22例月经周期正常妇女为对照组。采用反转录-聚合酶链反应技术(rt-pcr)对3组黄体中期的子宫内膜integrinβ3进行半定量分析。结果 与对照组相比,a组黄体中期子宫内膜integrinβ3的表达下降(p<0.05),b组表达差异无统计学意义(p>0.05)。结论 cc/hcg促排卵治疗降低了黄体中期子宫内膜容受性,加服补肾调经中药后可改善子宫内膜容受性。
【关键词】 补肾调经中药;子宫内膜;整合素β3;多囊卵巢综合征
effects of bushen tiaojing chinese herbs on endometrial integrinβ3 mrna expressions in patients with polycystic ovarian syndrome ran xue-meng, tai guo-xiang, chen qian (department of gynecology, qingdao hiser medical center, qingdao 266033, china)
abstract：objective to study the effect of bushen tiaojing chinese herbs on the expressions of endometrial integrin β3 in infertile patients with polycystic ovary syndrome (pcos) receiving ovulation induction therapies. methods thirty-six pcos related infertility patients were divided into 2 groups at random, receiving different ovulation induction therapies：17 patients of group a were given clomephine citrate (cc)/human chorionic gonadotropin (hcg) therapies, and 19 patients of group b were given cc/ hcg combined with chinese herbs therapies. 22 infertile women with fallopian tubal or male infactors were chosen as controls. the mrna expressions of integrin β3 in midluteal endometrium were measured by reverse transcription-polymerase chain reaction. results compared with controls, the expressions of endometrial integrin β3 were weaker in group a (p<0.05), and the significant differences were not founded in group b (p>0.05). conclusion cc/hcg ovulation induction therapies may induce the decline of endometrium receptivity during midluteal phase, which chinese herbs may promote.
key words：bushen tiaojing chinese herbs;endometrium;integrin β3;polycystic ovarian syndrome
胚胎着床是一个复杂的生理过程,受诸多因素调控。WWw.133229.coM已有研究显示,整合素β3(integrinβ3)特异性表达于着床窗口期的子宫内膜,是预测子宫内膜容受性的良好指标,与胚胎的种植密切相关。助孕技术的发展使促排卵药物的排卵率提高,但促排卵治疗后的妊娠率较低问题一直未能解决。本研究通过观察补肾调经中药对integrinβ3 mrna表达的影响,探讨中药提高妊娠率的子宫内膜分子学基础。
1 资料与方法
1.1 研究对象与用药
2008年2月-2009年2月就诊于本院妇科的多囊卵巢综合征(pcos)患者36例,年龄23～38岁。原发或继发不孕,不孕时间2～9年。按2003年鹿特丹会议的pcos诊断标准[1],均经通液或碘油造影检查证实输卵管通畅,3个月内未用任何激素类药物。
36例pcos患者随机分为a组和b组。a组：共17例,月经周期第5日(自然周期或黄体酮后撤退性出血)给予克罗米芬(cc,枸橼酸氯米芬片,h20040352,codal synto limited)口服50 mg/d,共5 d;b组：共19例,月经周期第5日给予cc口服50 mg/d,共5 d,同时加服中药(基本方：当归、白芍、熟地黄、山茱萸、续断、菟丝子各15 g,紫石英、香附、丹参、白术、茯苓各12 g,柴胡9 g),每日1剂。阴道b超监测卵泡发育,当优势卵泡直径≥18 cm时,2组均给予注射用绒毛膜促性腺激素(hcg,国药准字h44020673,丽珠集团丽珠制药厂)10 000 iu肌肉注射诱发排卵。a、b组间年龄、体重指数比较,差异无统计学意义(p>0.05)。
对照组：选择同期因男性、输卵管因素不育而就诊、月经周期28～30 d的妇女,共22例,年龄23～37岁。3个月内未用任何激素类药物。对照组年龄与a、b组比较差异无统计学意义(p>0.05),体重指数低于a、b组(p<0.05)。
1.2 标本采集
1.2.1 血清性激素测定 排卵后第7～8日取子宫内膜,当日抽血测血清雌二醇(e2)、孕酮(p)。
1.2.2 子宫内膜取材 用小号刮匙刮取少许子宫内膜组织,贮藏于-70 ℃超低温冰箱。
1.3 检测方法和步骤
1.3.1 提取总rna 用小量组织总rna抽提试剂盒提取总rna。提取的rna样品在波长260 nm和280 nm处吸光度(a)的比值保持在1.772～1.998之间,符合蛋白质污染容许容量,根据a值计算出总rna浓度。
1.3.2 设计引物 3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)作为内参照,所有引物采用primer5.0引物设计软件设计。引物序列及扩增片段见表1。表1 引物序列及扩增基因片段
1.3.3 扩增目的基因 采用美国promega公司accessquick tmrt-pcr system,分管在eppendorf pcr扩增仪上完成反转录和pcr的扩增。反应混合物包括pcr反应缓冲液25 μl,rna模板4.4 μg,反转录酶5 u,上、下游引物各为2.5 μl,反应体系为50 μl。引物序列及扩增基因片段见表1。反应程序为逆转录48 ℃ 45 min,随后立即进行pcr扩增：94 ℃预变性4 min, 94 ℃变性45 s,integrinβ3 55 ℃、gapdh 50 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min,integrinβ3 25个、gapdh 22个循环后,72 ℃总延伸10 min。
1.3.4 半定量分析 pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离、紫外透射/凝胶成像仪成像后进行半定量分析,标本integrinβ3/ gapdh灰度值的比值代表integrinβ3 mrna的半定量水平。
1.4 统计学方法
差异显著性检验采用方差分析、两两比较,spss10.0软件包处理数据,α=0.05。
2 结果
3组黄体中期血清性激素水平、integrinβ3 mrna表达的比较见表2。3组着床期血清e2、p水平比较差异均无统计学意义(p>0.05)。integrinβ3 mrna在对照组中的表达高于a组(p<0.05);与b组比较,差异无统计学意义(p>0.05);integrinβ3 mrna在b组中的表达高于a组(p<0.05)。表2 3组着床期血清性激素水平、integrinβ3 mrna表达的比较注：与对照组比较,*p<0.05;与a组比较,△p<0.05
3 讨论
整合素是一类普遍存在于细胞表面的跨膜糖蛋白,可特异性识别配体的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)三肽序列,从而介导细胞与细胞、细胞和细胞外基质(ecm)之间相互作用,发挥其粘附和信号转导两大功能,参与胚胎发育、免疫应答、创伤修复、恶性肿瘤转移等生理和病理过程。
integrinβ3是近年来国内外研究较多的细胞因子之一,其对胚胎着床所起的作用已基本得到了广泛的认可。研究表明,integrinβ3在子宫内膜的表达呈周期特异性。lessey等[2]用免疫组化方法研究了整合素在月经周期子宫内膜的表达,发现整合素α1、α4和β3、α3只可以在黄体期观察到(正常月经周期的15～28 d),β3和α1β3出现在黄体中期以后(正常月经第19日以后)。gonzalez等[3]用流式细胞仪发现,子宫内膜上皮细胞的α1、αv、β3在排卵后升高,分泌中期浓度最高;基质细胞的α1自增殖期到分泌期浓度持续增加,αv、β3在排卵后轻度增高,至分泌中期达峰值。dou等[4]用定量反转录聚合酶链反应(rt-pcr)分析整合素mrna的含量发现,αvβ3在分泌期显著增多;integrinβ3仅在月经周期第19日以后出现在子宫腺上皮和子宫内膜上皮。以上研究表明,integrinβ3出现时间与子宫内膜的种植窗期(月经周期第21～23日)开放同步,因而被认为是评价子宫内膜容受性的良好指标。
本研究结果显示,对照组及pcos患者促排卵后黄体中期血清雌孕激素水平差异不显著,提示促排卵药物对着床窗口期血清性激素水平的影响可能不大。与正常妇女自然排卵周期相比,cc/hcg促排卵方案导致pcos患者在着床窗口期子宫内膜integrinβ3表达的下降,说明促排卵治疗使人类的子宫内膜容受性受到损害,这可能是pcos患者在用促排卵药后排卵率高但受孕率低的原因之一。
pcos可归于中医学“月经病”、“不孕症”范畴,依据“经水出诸肾”、“肾主生殖”理论,临床上多从补肾调经论治。本研究所用方药中,熟地黄、当归、白芍、山茱萸补阴养血调经;续断、菟丝子、紫石英补肾助阳,在阴血中补阳,可以温煦子宫,提高黄体功能;柴胡、牡丹皮、香附、丹参理气活血调经;白术、茯苓健脾益气,以助调养气血。本研究发现,integrinβ3在pcos患者cc/hcg促排卵者的着床期子宫内膜表达弱,在cc/hcg加中药促排卵者和自然排卵周期妇女的着床期子宫内膜表达强,提示补肾调经中药增强了促排卵后着床期子宫内膜integrinβ3表达,改善了子宫内膜容受性,有利于孕卵着床。
【参考文献】
[1] rotterdam eshre/asrm-sponsored pcos consensus workshop group. revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome[j]. fertil steril,2004,81(1)：19-22.
[2] lessey ba, castebatum aj, buck ca, et al. further characterization of endometrial integrins during the menstrual cycle and in pregnancy[j]. fertile steril,1995,63：1210-1216.
[3] gonzalez rr, palomino a, boric a, et al. a quantitative evaluation of α1、α4、αv and β3 endometrial integrins of fertile and unexplained infertile woman during the menstrual cycle：a flow cytometric appraisal[j]. hum reprod,1999,14(10)：2485-2492.
[4] dou q, williams s, chengini n, et al. expression of integrin messager ribonucleic acid in human endometrium：a quantitative reverse transcription poly merase chain reaction study[j]. fertil steril,1999,71(2)：347-353.
