【摘要】 目的 评价脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cell,btsc）与胶质瘤细胞系shg44细胞放射敏感性的差异。方法 shg44细胞分别接种于含10％胎牛血清的dmem/f12培养基和无血清的dmem／f12培养基(添加bfgf和egf)中。cd133免疫细胞化学染色鉴定btsc。0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、20 gy x线照射shg44细胞和btsc后以流式细胞仪检测两种细胞的细胞周期及细胞凋亡率，绘制shg44细胞和btsc的存活曲线。结果 shg44细胞中存在btsc，后者能在无血清的dmem／f12培养基中存活并悬浮生长，增殖形成克隆球，具有自我更新和增殖能力，表达特异性标志物cd133。两种细胞在x线照射后细胞周期无明显差异，btsc的细胞凋亡率低于shg44细胞(p<0.05)，细胞存活率高于shg44细胞(p<0.01)。结论 btsc的放射敏感性较shg44细胞明显降低，是胶质瘤放疗抵抗的主要原因。
【关键词】 脑肿瘤干细胞；shg44细胞；胶质瘤；放射敏感性
experimental research of radiosensitivity for brain tumor stem cell
ke jin1,he jie2（1.department of oncology,zhongda hospital,southeast university,nanjing 210009,china；
2.department of pathology,fourth people′s hospital of wuxi,affiliated to suzhou university,wuxi 214062,china）
abstract：objective to evaluate difference of radiosensitivity for brain tumor stem cell(btsc) and human glioma cell line shg44 cell.methods shg44 was cultured in dmem/f12 supplemented with 10％ fbs,and in serumfree dmem/f12 containing bfgf and egf respectively.btsc was detected by immunocytochemistrical staining with antibodies against cd133.btsc and shg44 cell were irradiated by xrays with doses of 0,0.5,1,2,3,4,6,8,10,20 gy respectively,and flow cytometry assay was used to detecte the apoptosis and analyze the changes of cell cycles.cell survival curves of btsc and shg44 cell were determined by the measure of cell clone formation.results shg44 cell contained btsc,which could survive and grow by means of suspension in serumfree medium and proliferate into the clonal sphere.the clonal spheres maintained strong ability of selfrenewal and proliferation.the specific marker cd133 could be expressed by btsc.after btsc and shg44 cell were irradiated by xrays,flow cytometry assay showed that no different could be found in cell cycles and the ratios of apoptosis in btsc were lower than that of shg44 cell significantly(p<0.05).the cell survival curves assay showed that the ratios of cell clone formation in btsc was higher than that of shg44 cell(p<0.01).conclusions radiosensitivity of btsc is lower than that of shg44 cell, and it is main cause of glioma radioresistence.
key words:brain tumor stem cell；shg44 cell；glioma；radiosensitivity
（modern medical journal,2009,37:192194）
脑胶质瘤(neurogliocytoma)是最常见的颅内原发性肿瘤，占中枢神经系统肿瘤的60%以上，无论放疗、化疗还是手术治疗，恶性胶质瘤患者的中位生存期只有14.6个月［1］。wWW.lw881.com放疗是脑胶质瘤最有效的治疗手段之一，但由于肿瘤的放疗抵抗性使得相当一部分患者在放疗后出现复发。最近研究发现，脑肿瘤中存在具有自我更新特性的细胞亚群即脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cell，btsc)，是引发肿瘤并维持其生长的根源，并在肿瘤的复发过程中起着决定性作用［2］。放疗失败的原因可解释为放射线并没有将肿瘤干细胞全部杀死,存活下来的肿瘤干细胞具有无限增殖能力,能继续促进肿瘤生长。本研究旨在探讨btsc在胶质瘤放疗抵抗性中的作用及其可能的机制。
1 材料和方法
1.1 材料
胶质瘤细胞系shg44细胞（上海中国科学院），dmem／f12(1∶1)培养基(南京天为公司)，胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶(sigma公司)，人表皮生长因子(egf，peprotech公司)，人碱性成纤维生长因子(bfgf，peprotech公司)，兔抗cd133多克隆抗体（abcam公司）。
1.2 方法
1.2.1 shg44细胞的培养和传代 shg44细胞接种于含10％胎牛血清的dmem/f12培养基中，在37 ℃、5％co2的饱和湿度培养箱中培养。5～7 d后按1∶2 或1∶3的比例传代。
1.2.2 btsc的培养和传代 shg44细胞接种于含egf（20 ng·ml1）和bfgf（20 ng·ml1）的无血清dmem/f12培养基中，在37 ℃、5％co2的饱和湿度培养箱中培养。待btsc增殖形成干细胞球3、4 d后，吸取上清液体培养基(含细胞球)重新吹打成单细胞悬液，按1∶2或1∶3的比例传代。
1.2.3 btsc的鉴定 用btsc的特异性标记物cd133进行免疫细胞化学染色，将细胞离心后滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，静置待干，100％的丙酮固定，正常血清封闭，抗cd133一抗孵育4 ℃过夜，二抗孵育37 ℃ 30 min，dab染色5～10 min，每步骤间均用0.01 mmol·l-1pbs冲洗3遍，封片后显微镜下观察。
1.2.4 实验分组及照射 两种细胞均各自以随机数字法设立对照组及照射组，照射组进一步分为0.5、1、2、3、4、6、8、10、20 gy剂量组。除对照组不照射外，两种细胞均采用西门子直线加速器md7745照射，室温下进行。
1.2.5 绘制细胞存活曲线 对照组和照射组细胞孵育24 h，收集细胞，接种于24孔板中（200个细胞·皿-1）。2周后用giemsa染色，在显微镜下计数含50个细胞以上的克隆，并计算细胞存活率，绘制shg44细胞和btsc的存活曲线。
1.2.6 流式细胞术 取经0、2、4、8、10、20 gy x线照射后的两种细胞，孵育48 h，收集106个细胞，用流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期。
1.3 统计学处理
实验结果采用单因素方差分析，p<0.05表示差异有统计学意义，由spss 13.0软件完成。
2 结 果
2.1 shg44细胞的生长和btsc的形成、增殖
在含血清培养基中，shg44细胞呈贴壁生长并交织成网状（图1）。在无血清培养基中，培养3～4 d后一小部分细胞形成btsc，并能自我增殖成克隆球，呈球形或卵球形，大小不一，折光性较强，悬浮生长，取克隆球吹打成单细胞后重新培养，3 d后可见克隆球重新生成（图2）。
2.2 btsc的鉴定
cd133免疫细胞化学染色可见克隆球呈棕黄色，cd133定位在细胞膜（图3）。
2.3 x线对shg44细胞和btsc的影响
shg44细胞和btsc存活曲线（图4）显示，随着照射剂量的增加，两种细胞的存活率出现下降，但btsc的存活率明显高于shg44细胞（p<0.01）。流式细胞仪检测结果显示，两种细胞的细胞周期无明显差异。随着x线照射剂量的增加两种细胞的凋亡率均升高（图5），但btsc的凋亡率明显低于shg44细胞(p<0.05)。
3 讨 论
人们对于肿瘤干细胞(tumor stem cell，tsc)的认识最初来自于对白血病的研究，认为在肿瘤的发生和发展过程中仅仅只有一小部分细胞具有广泛的增殖和自我更新能力,被称为肿瘤干细胞。随着singh等［3］从多种脑肿瘤中分离出肿瘤源性细胞，tsc的存在得到证实。tsc学说［26］认为，脑胶质瘤内存在与神经干细胞性质相似的细胞，即tsc，它们参与了脑肿瘤的形成。这些细胞在体外可形成神经球，能够自我更新，具有无限增殖、多向分化潜能以及高致瘤性。tsc学说之所以近年逐渐升温，得益于免疫学技术的发展和干细胞标记物的出现。tsc和神经干细胞存在很多共同特征，两者存在一些共同的表面标记，如cd133和nestin。cd133是一种分子量为120ku 的细胞表面蛋白，nestin属于中间微丝，两者是比较公认的tsc表面标志物。tsc表面标志物为cd133和nestin。
本研究采用悬浮培养法。在添加生长因子的无血清培养基中，btsc呈悬浮球样生长，而除此之外的大部分细胞贴壁生长，故为初步分离培养tsc提供了一种有效的方法。本实验原代培养的接种密度约为1×106 ml-1，传代密度为1×105 ml-1。培养发现：接种的密度较高，细胞球的形成速度较快。
本研究发现胶质瘤细胞系shg44细胞和btsc接受x线干预后，btsc的存活率高于shg44细胞，凋亡率明显低于shg44细胞，表明btsc的放射敏感性低于shg44细胞。放射生物学在放疗机制中认为，dna是放射线对细胞作用最关键的靶，射线对dna损伤越大，对肿瘤细胞的打击越大，放疗敏感性就愈高。但若dna损伤后能很快修复，就不会出现肿瘤细胞的死亡，也就是产生放疗抵抗性［7］。btsc的放疗抵抗性可能与dna损伤的修复有关。bao等［8］发现，胶质母细胞瘤放射抵抗和cd133+细胞亚群有关，常规放疗后，瘤组织中cd133+亚群相对比例增加，而cd133-亚群减少。cd133+细胞（btsc）可通过优先激活dna损伤检查点蛋白提高放疗抵抗性。放疗后cd133+细胞检查点蛋白（atm、rad17、chk1、chk2）的磷酸化较cd133-细胞明显升高，这使其修复dna的损伤更加有效，并且用检查点激酶(chk1和chk2)特异性抑制剂（dbh）［9］能够逆转btsc的放射抵抗性［8］。同样，shiloh等[1011]在对横纹肌样型脑膜瘤的cd133+细胞放疗抵抗性的研究中发现，放疗后cd133+细胞较cd133-细胞优先激活dna损伤检查点蛋白（atm、rad17、chk2）和抗凋亡基因（bcl2、bclxl），并且dna损伤修复基因（atm、gadd45、ku80、ercc5）表达增加。此外，脑肿瘤干细胞放射敏感性还可能与影响细胞周期调控、抗细胞凋亡及信号转导通路的改变有关。
总之，随着tsc研究的深入，利用tsc学说解释胶质瘤放疗抵抗性的机制，为克服胶质瘤放疗抵抗提供了新思路。
【参考文献】
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