摘要：芸薹属包括多种蔬菜和油料作物，是与人类生产、生活关系最密切的一个属。为了研究白菜型油菜与其近缘种间的杂交亲和性及杂种后代的遗传特征，采用剥蕾去雄和人工授粉方法进行小白菜与甘蓝型油菜种间杂交AACC×AcAc以及小白菜与黄芽白不同栽培种间杂交AcAc×AhAh，并分析杂种后代的表型、花粉育性和细胞学等遗传特征。结果表明，AACC×AcAc杂交组合杂交授粉亲和性差，在授粉后出现胚发育夭亡现象，以较低的比例获得了杂种后代，杂种后代表现出生物产量高、生命力旺盛、生长势较强等特点。杂交组合AcAc×AhAh获得杂种后代的比例较高，杂种后代植株较矮小。AACC×AcAc杂种后代花粉母细胞减数分裂过程中有单价体、不均等分离等异常现象出现，与之相应其花粉育性和结实率也较差。AcAc×AhAh杂种后代花粉母细胞减数分裂过程中染色体联会正常，所有染色体都形成二价体，后期I染色体也是均等分离，因此花粉育性好，结实率高。芸薹属杂种后代合成及其遗传特征研究有助于芸薹属栽培植物遗传资源拓展和新品种培育。
关键词：白菜型油菜；甘蓝型油菜；远缘杂交；细胞遗传
中图分类号：S634.303文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2021）24-0085-05
收稿日期：2021-03-27
基金项目：国家自然科学基金（编号：31460357）；江西省自然科学基金（编号：20202BABL205017）；江西省教育厅科研项目（编号：GJJ170908）。
作者简介：朱永生（2000—），男，江西新干人，主要从事植物遗传育种研究。E-mail：2991753843@qq.com。
通信作者：陈纪鹏，博士，副教授，主要从事油菜远缘杂交和细胞遗传研究。E-mail：chensi20020606@163.com。
随着现代育技术的不断发展，芸薹属植物中现有的遗传资源却越来越稀少，而远缘杂交在近缘物种基因资源拓展、改良植物新品种和创造植物新类型方面具有重要作用[1-2]。芸薹属植物杂交后代常表现出较高的生物产量、旺盛的生长活力、生长势强等杂种优势，并可将近缘种的优良基因引入栽培种[3-5]。当前芸薹属栽培种由于不断地进行人工选择以及气候环境的影响，导致其种内的遗传多样性显著减少，而用于品种选育的亲本资源也不断下降。采用不同栽培种间杂交以及不同种间杂交甚至亲缘关系更远的杂交，合成芸薹属远缘杂种，即为芸薹属栽培种，创造新的遗传类型、转入有利基因用于植物的遗传改良、提高栽培种的品质及产量[6-9]。
芸薹属植物种类繁多，物种丰富广泛，包含很多的亚种、变种和栽培种，是重要的蔬菜、油料和药用植物。甘蓝型油菜是重要的油料作物之一，起源于欧洲，培育年限较短，遗传基础较窄，但是它角果大、籽粒大、结籽数多。白菜型油菜栽培历史悠久，遗传资源非常丰富，具有耐贫瘠、耐旱、耐寒等特性，可根据这些物种之间的差异，来丰富我国油菜育种的遗传基础[10]。利用甘蓝型油菜与白菜型油菜二者进行种间杂交和种内杂交丰富甘蓝型油菜的遗传资源是当前常用的育种方法[11，12]。本试验采用人工去雄和辅助授粉的方式进行甘蓝型油菜与小白菜杂交和小白菜与黄芽白之间杂交，并结合胚培养的方式获得杂种后代，观察雜种后代的遗传学特征，创建芸薹属育种新材料。
1材料与方法
1.1试验材料
采用甘蓝型油菜湘油15（Brassicanapusvar.xiangyou15）与白菜型油菜栽培种小白菜（B.rapavar.chinensis）进行种间杂交获取种间杂种后代AACC×AcAc。以小白菜和黄芽白（B.rapavar.huangyabai）做亲本进行不同栽培种间杂交获取种内杂种AcAc×AhAh。于2017年10月上旬在田间种植上述亲本材料。由于白菜型油菜生育期较短，所以白菜型油菜适当晚播以使父母本花期相遇。
1.2人工杂交
第2年春季油菜盛花期，采用人工去雄和辅助授粉的方法进行杂交。选择晴朗天气，对母本进行人工剥蕾去雄，并立即用牛皮纸袋套上，别好回形针，做好标记，同时对父本也用牛皮纸套好，以防止花粉被污染。第2天上午取前1d套好袋且刚刚开放的父本花朵对前1d去雄的母本进行授粉，授粉之后再用纸袋套好，做好标记。后期进行胚培养或收获种子，以获得杂种数与授粉花杂数之比作为亲和指数，代表杂交亲和性。
1.3胚培养
授粉大约15d左右（具体时间视杂种胚发育时期确定），从母本植株上取下授粉后膨大的角果进行胚培养。先用70%乙醇对角果表面消毒2～3min，然后浸入0.1%的氯化汞溶液中浸泡15min，从氯化汞溶液中取出后用无菌水漂洗3次，将角果表面残留的有害药剂洗净。在超净工作台的无菌环境下，轻轻将角果剥开后，从胚珠中取出幼胚接种于MS培养基表面，置于20℃，光周期为12h/24h的环境下培养。待幼胚长出芽时，把芽转接种在MS+0.25mg/LNAA+1.5mg/L6-BA的培养基扩繁。最后将幼苗转入MS培养基中生根培养，待幼芽的根长出较多后移栽到田间。
1.4杂种后代花粉育性观察
在杂种植株盛花期观察杂种植株花粉育性。在天气晴朗的上午取杂种植株刚开放的花药，每株2枚放在载玻片上，滴醋酸洋红染色液，再用摄子将花药压破使花粉粒散出，并去除花药壁残片。盖上盖玻片，轻轻按压后置于显微镜下观察。有活力的花粉粒在显微镜下是大而圆的，而且着色比较深，而不育的花粉则表现为小而瘪，不容易被染色，颜色较浅，从而可以区分可育花粉和不育花粉。每个杂交组合选10株进行花粉育性观察，每株观察花粉至少100粒，统计可育花粉所占的比例。
1.5杂种后代减数分裂细胞学观察
为了观察花粉母细胞减数分裂，在杂种植株初花期摘取其幼嫩花蕾，用卡诺固定液（无水乙醇与冰乙酸体积比为3∶1混合溶液）进行处理，处理时间≥24h，处理完成后浸泡于75%乙醇中并贮藏于-20℃的冷冻箱中备用。观察时取出备用的幼嫩花蕾放入盛有清水的培养皿中清洗残留花蕾表面的乙醇，接着用镊子从花蕾中取出1～2个花药放于盛有1mol/LHCl溶液的烧杯中，并在温度为60℃水温中水浴加热水解2min，然后取出花药用清水漂洗去HCl，最后将处理完成的花药放于盖玻片上并用镊子将花药压破使花粉母细胞散出，再用卡宝品红进行染色，盖上盖玻片并压片，放于高倍显微镜下观察花粉母细胞减数分裂。将所观察到的花粉母细胞减数分裂图片拍照保存。
2结果与分析
2.1杂交亲和性比较
通过人工去雄、辅助授粉和胚培养，在以小白菜为母本、黄芽白为父本的杂交组合（AcAc×AhAh）以较高的亲和指数（1.91）获得杂种后代植株。而以甘蓝型油菜为母本、小白菜为父本的杂交组合（AACC×AcAc）亲和指数只有0.29）。AcAc×AhAh组合通过人工授粉进行杂交，观察杂交亲和性，共调查225荚，在这些荚中空荚的数目有13个，占总数的5.7%，有种子的荚中平均每荚结籽数目有1～5粒，占总数的8.7%籽粒不饱满，不能正常发芽。AACC×AcAc组合授粉的花朵只有不到50%种子发育形成角果，其他的由于没有继续发育而凋落。发育的种子也有较多不饱满不能正常发芽，杂交成功率较低（表1）。
授粉后15d左右，取部分角果进行胚培养，培养5d后幼胚开始成长出浓密的白色根毛，10d左右就开始形成真叶，但多数幼苗生长畸形。生长20～30d时剪幼芽继代培养便获得生长旺盛的幼苗。移栽前30d转入不加任何激素的MS生根培养基，全部幼苗都能正常生根。AcAc×AhAh组合和AACC×AcAc组合分别以0.80和0.62的成功率获得杂种植株（表2）。
2.2杂种后代形态学特征
AACC×AcAc杂交后代植株的叶片形态和叶片大小接近甘蓝型油菜，苗期叶裂比甘蓝型油菜更深，叶的长度长于甘蓝型油菜，叶的颜色与甘蓝型油菜相似，在叶片表面还覆盖了一层薄薄的蜡质（图1-A、B）。杂种植株花呈黄色，形态与甘蓝型油菜相似，开花较早，花期与亲本相比较长。推测可能是由于杂种结实率低，在生长过程中生殖生长时间短从而消耗营养较少。杂种植株雌蕊外观形态发育正常，但雄蕊发育不完全，花丝短，花药中花粉含量少，可育花比例低（图1-C）。成熟期杂种植株形态与甘蓝型油菜相似，分枝较多，生长旺盛，表现出一定的杂种优势；花期较长，田间自由授粉情况下能产生少量种子，每个角果5～10粒种子发育成熟。
AcAc×AhAh杂交组合中，杂种植株的叶片形态和大小与亲本相似，有些杂种植株表面都覆盖一层长毛，表面粗糙（图2-A、图2-B、图2-C）。杂种植株株高接近双亲，第一分枝高度却远远高于两亲本，一级分支数高于两亲本，每株角果数介于两亲本之间，大部分种子都能发育成熟（表3）。
2.3花粉母细胞减数分裂
AACC×AcAc杂交后代虽然营养生长旺盛，在形态上表现出较强的杂种优势，但花粉母细胞减数分裂过程中出现较多的染色体行为异常。如染色体联会时出现单价体，后期有的细胞出現落后染色体或染色体桥（图1-D）。因此，杂种后代花粉育性较低，而且自交结实率低。而AcAc×AhAh杂种后代花粉母细胞减数分裂各个阶段染色体行为表现正常，花粉形成过程正常，花粉粒育性良好（图2D）。从图2-E可以看出，花粉母细胞处于减数第一次分裂后期，细胞的染色分别移向细胞的两级，没有出现染色体落后现象，染色均等分离，细胞的两级均得到一个完整的染色体组。
3结论与讨论
随着现代生物技术在遗传育种中应用越来越广泛，克服远缘杂交中生殖隔离，并不断获得新品种，为芸薹属植物遗传改良提供了丰富的资源基础[13-15]。为了利用作物种间优良的遗传资源，用小白菜与黄芽白、小白菜与甘蓝型油菜进行杂交，并且通过人工去雄、辅助授粉和胚培养等辅助方法获得了后代杂种。黄芽白和小白菜进行杂交，亲和性好，结实正常，杂交种子没有出现结籽异常的现象，表明小白菜型油菜种内不同栽培种之间杂交容易进行。而甘蓝型油菜与小白菜之间杂交亲和性较差。在众多植物远缘杂交中，两亲本的染色体数目的多少也会影响杂交的亲和性[16]。母本选择染色体数量多的杂交后代更容易获得[17-18]。在本试验中，小白菜与甘蓝型油菜间杂交的组合中，选用染色体少的小白菜做母本，染色体数量多的甘蓝型油菜做父本，授粉后20d进行统计，出现了杂交结籽异常的情况，杂交不亲和，结籽粒少，荚内发芽数多等情况，还有些胚乳出现严重败坏的现象，胚死亡而没有得到杂种种子。而在以甘蓝型油菜为母本的反交组合中，两亲本的亲和性表现较好。外界环境因素是影响油菜远缘杂交亲和性大小的因素之一[19]。外界环境因素也会对油菜杂交产生一定的影响，长日照高温之所以会提高植物杂交亲和力，主要是长日照高温促进植物受精作用，使得植株受精过程中的生理生化反应得以改变[20]。随着现代科学和生物科技的不断发展，较好地克服了远缘杂交的不亲和性，并为油菜育种提供了另一方法与途径。选用的杂交组合不一样，杂交后代的亲和性也不同[21]。杂交亲本的选择和外界环境因素共同作用影响杂交亲和性，在棉花杂交中也出现类似情况[22]。
远缘杂交不亲合表现在有性繁殖过程的多个环节。花粉管生长迟缓且畸形，导致花粉无法到达胚珠而出现受精受阻的现象；还有一种原因可能是因为在人工杂交的过程中，花粉的黏合性比较差，花粉很难一直保持在柱头上；受精后因为远缘杂交的植株之间产生的不亲和性，胚乳又表现出败坏，最终出现胚死亡的现象。总的来说，一般情况下的人工杂交难以获得成功，因此，胚培养是克服杂种幼胚夭亡最有效的方法，许多远缘杂种通过人工杂交结合胚培养而获得[22]。
