【关键词】 肝细胞；低氧预处理；二维蛋白电泳；大鼠
experimental study on rat hepatocytes proteins after hypoxic preconditioning by two-dimensional gel electrophoresis chen wei， wu zhiyong， sun yongwei， et al. department of general surgery， renji hospital， shanghai jiaotong university， school of medicine， shanghai 200127
abstract objective to analyze rat hepatocyte proteins with two-dimensional gel electrophoresis and to provide a basis for exploring the mechanism of hypoxic preconditioning protecting hepatocytes from hypoxia/reoxygenation injury. methods hepatocytes were divided into 2 groups： control group and preconditioning group. two-dimensional gel electrophoresis (2-de) was used with immobilized ph gradients (ipg) to compare the differential expression of proteins in control group hepatocytes and preconditioning group hepatocytes. proteins were shown with silver stain. results about 260 protein spots were identified in each of the 2-de gel patterns with silver stain. most of them showed no difference in composition， shape or density. there were 11 differential protein spots between the two groups and their molecular weight and isoelectric point were identified primarily. these 11 protein spots were seen to be unique in one region or the other (5 in control group hepatocytes， 6 in preconditioning group hepatocytes). conclusion the hepatocyte proteins can be identified with a certain precision by two-dimensional gel electrophoresis. hypoxic preconditioning can change protein expressions of rat hepatocytes. new proteins in the preconditioning group hepatocytes are probably associated with anoxia resistance.
key words hepatocyte； hypoxic preconditioning； two-dimensional gel electrophoresis； rats
低氧预处理能提高肝细胞对低氧的耐受性，减轻再灌氧损伤，然而，我们仍不清楚低氧预处理后肝细胞内各种细胞因子的变化[1]。wWw.133229.coM我们利用基因芯片技术研究低氧预处理后肝细胞基因表达谱的变化，发现低氧预处理对肝细胞的保护作用可能通过多个途径来实现[2]。因此，我们运用蛋白组分析技术，以获得正常肝细胞和低氧预处理后肝细胞的蛋白电泳图谱，并加以分析，以发现与低氧预处理相关的蛋白质分子，为今后从蛋白质水平上进一步研究低氧预处理保护肝细胞的机制打下基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料 粗制iv型胶原酶、碘代乙酰胺和temed（美国sigma公司）；95%n2-5%co2混合气体和95%o2-5%co2混合气体（上海比欧西气体公司）；尿素、甘氨酸和二硫苏糖醇（dtt）（美国biobasic公司）；chaps、pharmalyte3-10、ipg 缓冲液，覆盖油和预制ipg胶条（ph 3~10，线性）（瑞典amersham pharmacia公司）；tris、十二烷基磺酸钠（sds）和过硫酸铵（美国amresco公司）；二维电泳蛋白标准品（美国bio-rad公司）。
queue2711三气培养箱（美国parkersburg公司）；multiphor ii electrophoresis system（瑞典amersham pharmacia公司）；proteantm ii垂直电泳槽和pdquesttm 2-d图像分析软件（美国bio-rad公司）。
雄性sprague-dawley大鼠10只，由中国科学院上海实验动物中心提供，质量为200~250 g，标准条件饲养。
2.1 实验方法
2.1.1 大鼠肝细胞的分离、纯化和培养 参照seglen[3]的方法，并略作改进，即大鼠肝脏活体原位灌注，消化成熟后切下并撕碎肝脏，肝组织悬液经100目钢网过滤，滤液50 g离心2 min，将沉淀混悬于50 ml pbs中，50 g离心2 min，弃上清，反复3次，最后将沉淀混悬于rpmi-1640培养基，调整细胞密度为5.0×105/ml，接种于75 cm2细胞培养瓶，每瓶15 ml，在queue三气培养箱内（95%o2-5%co2，37℃）培养24 h，使肝细胞达到稳定状态。
2.1.2 肝细胞分组和处理 rpmi-1640细胞培养液在三气培养箱内分别和95%n2-5%co2混合气体及95%o2-5%co2混合气体达到平衡，形成无氧培养液和富氧培养液。肝细胞培养24 h后，分成二组：①对照组（control group）：更换富氧培养液，95%o2-5%co2三气培养箱内，37℃，孵育170 min；②预处理组（preconditioning group）：更换无氧培养液，95%n2-5%co2混合气体迅速灌入培养瓶，使瓶内充满95%n2-5%co2混合气体，封住瓶口，37℃，孵育10 min后，更换富氧培养液，95%o2-5%co2混合气体灌入培养瓶，95%o2-5%co2三气培养箱内，37℃，孵育160 min。
2.1.3 样品的准备 用trizol试剂分别提取对照组和预处理组细胞的总蛋白（按说明书操作），1%sds溶解后，加入至少5倍体积的裂解液（8m尿素、4% chaps、2% pharmalyte3-10和1% dtt，去离子水配制），分装，-70℃冻存备用。用bradford法测定样品液中蛋白质的浓度。为了确定待测样品在二维电泳图谱中的等电点和分子量，便于定量分析，在样品中加入已知等电点和分子量的二维电泳标准蛋白作为内标，与样品作同步电泳测定蛋白等电点和分子量。标准蛋白的等电点和分子量详见说明书。
2.1.4 第一向等电聚焦（isoelectric focusing，ief）
将ipg胶条（ph 3~10，线性，13 cm）置于水化槽，取上述两种蛋白质样品各100 μg，分别加入水化液（8m尿素、2% chaps、1% dtt和0.002%溴酚兰，去离子水配制）至终体积达250 μl，混匀后加到槽内水化ipg胶条，并过夜。ipg胶条完全水化后，在如下条件中进行一维等电聚焦分离：第一步500 v，1 h；第二步3 500 v，7 h，总聚焦时间25 000 vh。
2.1.5 ipg胶条的平衡 等电聚焦结束后取出ipg胶条，放在平衡缓冲液i中（0.05m tris-hcl，ph8.8、6m尿素、30%甘油、2% sds和1% dtt，去离子水配制），平衡15 min，然后移入平衡缓冲液ii中（4%碘乙酰胺代替dtt，余同前），平衡15 min。
2.1.6 第二向sds电泳 用垂直板电泳槽，根据 说明书进行操作，配制12.5% sds-page分离胶 18 cm×16 cm×0.1 cm两块。平衡结束后，取出ipg胶条，放在分离胶的上缘，并用0.5%低熔点琼脂糖封盖以固定ipg胶条，电泳槽中加sds电泳缓冲液，15℃，恒流40 ma（20 ma/胶），电泳约5 h，指示剂抵达底边时终止电泳。
2.1.7 检测蛋白质点采用银染法 ①10%乙酸和40%甲醇混合溶液固定两次，每次15 min；②30%甲醇、0.2%硫代硫酸钠和6.8%乙酸钠混合溶液敏化30 min；③双蒸水漂洗3次；④0.25%硝酸银溶液染色20 min；⑤双蒸水漂洗2次；⑥2.5%碳酸钠和1∶2500甲醛混合溶液显色；⑦1.46% edta溶液终止。
每一块银染后的凝胶经透射式激光扫描仪（600 bpi分辨率）扫描后，所得图谱借助2-d图像分析软件pdquest7.0分析蛋白质二维电泳图谱，进行蛋白质斑点检测和配比，找出差异明显的蛋白点，并把这些差异表达的蛋白质分为2类：a类，预处理组肝细胞中表达而对照组中无表达；b类，对照组肝细胞中表达而预处理中无表达。根据标准蛋白质分子指示的位置及线性ph梯度，测出差异蛋白质的等电点和分子量。
3 结果
3.1 细胞分离和培养 肝细胞平均得率为（1.6±0.3）×108/肝，活力（93.63±2.7）%，纯度95%以上。
3.2 二维蛋白电泳的分辨率和重复性 每种样品的二维电泳重复4次，在预处理组和对照组中各选取4张蛋白图谱，应用pdquest软件进行图像分析，分别可分辨出约260个蛋白点，即可分辨出同样数量种类的蛋白质（见图1和图2）。图1a选取的是预处理组肝细胞蛋白的电泳扫描图，图1b为重复进行的电泳扫描图。结果表明，同种蛋白样品经重复进行的电泳扫描图谱蛋白斑点匹配率约为95%，绝大部分蛋白都能较好地重叠，重复性较好，分辨率较高。
3.3 对照组和预处理组肝细胞蛋白质的二维电泳图谱比较 图2和图3为本实验建立的具有代表性的对照组和预处理组肝细胞蛋白二维电泳图。图2为参考图谱，图3蛋白斑点与之比较，根据斑点的位置、大小、形状等参数，图像分析软件自动将不同图谱中的相同蛋白点匹配，不能匹配的差异点可自动标出。检测显示，两组肝细胞的蛋白质图谱中绝大多数蛋白点在位置、大小和形状上几乎一致。通过比较，我们发现了11个有明显差异的蛋白点(见表1)。
4 讨论
二维蛋白电泳技术是当前分离组织、细胞蛋白最有效的分离手段。蛋白质组研究的主要手段是二维蛋白电泳、计算机图像分析和蛋白质鉴定技术。二维电泳是前提，其分离效果直接影响图像分析和鉴定。在处理样品时应该尽量设法使样品中所有的蛋白溶解，为了获得高分辨率，还必需加入还原剂如dtt来还原所有的二硫键，或者加入尿素使蛋白质复合物完全变为多肽链[4]。本实验采用瑞典amersham pharmacia公司的multiphor ii电泳系统和ipg胶条进行等电聚焦，将样品直接加入水化溶液，一方面节省了水化溶液，提高样品溶解性；另一方面避免了样品杯的使用，从而避免在胶面某一点加样所致蛋白质沉淀产生，简化操作程序，提高样品量、分辨率和重复性，获得较好的图像效果。
在低氧预处理保护肝细胞或缺血预处理保护肝脏机制研究中，目前还主要停留在基因水平，在蛋白水平上少见。本实验中，我们采用ph 3~10宽ph范围二维电泳对大鼠肝细胞的全蛋白质进行等电聚焦，sds-page凝胶面积为130 mm(160 mm，厚度为1 mm，所分离的蛋白斑点为260个左右，通过对正常肝细胞和预处理后肝细胞的蛋白电泳图谱进行分析，找出有明显差异的蛋白质点。
低氧预处理或缺血预处理的保护机制十分复杂，可能和细胞内一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，nos）水平提高，合成大量no有关[5-6]；也可能和各种蛋白激酶（protein kinase，pk）激活有关，如蛋白激酶c（protein kinase c，pkc）、核转录因子кb（nuclear factor kappa b，nf-кb）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，mapk）等[7-9]，这些因子都能提高组织器官抗损伤能力。从基因水平筛选抗损伤基因，是当今研究的一个重要方法，但由于蛋白质是细胞生命活动及其功能的主要执行者，不同的蛋白质分子承担着不同的功能，因此，直接从蛋白质水平比较和筛选与抗损伤相关的蛋白质分子具有更重要价值。
原代培养的肝细胞经低氧预处理后明显耐受长期低氧造成的损伤，表明细胞内的某些基因或蛋白表达升高或降低。我们发现的这11个差异蛋白点中，有6个蛋白点（3，4，5，6，7，10）在预处理组中表达，而对照组中未出现，提示这些蛋白质的表达可能与细胞耐受低氧有关。另外，与对照组相比，预处理组中有5个蛋白点（1，2，8，9，11）未出现，这些消失的蛋白质在损伤和抗损伤机制中究竟起什么作用，有待于进一步研究。
通过二维蛋白电泳技术，我们获得多个较纯的蛋白点，随后可以利用蛋白质鉴定技术，比如质谱技术或定量差异分析技术来获得每个蛋白或多肽的分子量或序列，然后在数据库中进行搜索[10-11]，推断出是何种蛋白和肽或未知蛋白和肽。
当然，我们应用此方法并未展示出肝细胞全部蛋白质，虽然银染方法非常灵敏，但其灵敏度也有一定限度，因而还有许多蛋白质未检测出。另外，我们使用了ph 3~10的ipg胶条，而ph<3、ph>10的蛋白质未包括在内。第二向sds-page仅展示出分子量在14 000~100 000范围内的蛋白质，而<14 000，>100 000的蛋白质分子未包括在内，且在此研究的图谱中有一些蛋白质点重叠在一起无法分辨，尤其在高分子量区。如果充分显现出肝细胞的蛋白质，可能会发现更多有价值的蛋白质分子。
图1显示了预处理组肝细胞蛋白的2张电泳图谱，说明主要的高丰度蛋白斑点的重复性尚可，而其他的低丰度蛋白的重复性尚待提高，其可能的原因如下：①所选样品的初始状态，样品处理的重复性，试剂的批号和灌胶均匀与否，直接影响斑点位置的重复性。②染色过程中凝胶染色时间的长短和终止时间长短影响蛋白的定量和凝胶中斑点的大小，对位置变异也有影响。③在图像扫描中，所选取的凝胶的像素影响位置变异。因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。
本实验建立二维电泳分离肝细胞蛋白质的方法，比较对照组和预处理组肝细胞蛋白质在二维电泳图谱中的差异，为研究这些分子在低氧预处理预防低氧再灌氧损伤机制中的地位和作用以及它们的结构和功能提供了实验基础。
【参考文献】
[1] carini r， grazia mc， spendore r， et al. ischemic preconditioning reduces na+ accumulation and cell killing in isolated rat hepatocytes exposed to hypoxia[j]. hepatology，2000，31(1)： 166-172.
[2] 陈炜，吴志勇，邱江峰，等. 大鼠肝细胞缺氧预处理后基因表达谱的改变[j]. 中华外科杂志，2005，21(43)：1405-1406.
[3] seglen po. preparation of rat liver cells. iii. enzymatic requirements for tissue dispersion[j]. exp cell res，1973，82(2)：391-398.
[4] babu gj， wheeler d， alzate o， et al. solubilization of membraneproteins for two-dimensional gel electrophoresis： identification of sarcoplasmic reticulum membraneproteins[j]. ann biochem，2004，325(1)：121-125.
[5] peralta c， hotter g， closa d， et al. the protective role of adenosine in inducing nitric oxide synthesis in rat liver ischemia preconditioning is mediated by activation of adenosine a2 receptors[j]. hepatology，1999，29(1)：126-132.
[6] 侍阳，钱海鑫，秦磊，等. 大鼠肝缺血/再灌注后肝组织一氧化氮和不同亚型一氧化氮合酶的变化[j]. 肝胆胰外科杂志，2008，1（20）：13-15.
[7] carini r， grazia mc， splendore r， et al. signal pathway involved in the development of hypoxic preconditioning in rat hepatocytes[j]. hepatology，2001，33(1)：131-139.
[8] li xc， ma yf， wang xh. role of nf-kappa b as effector of ipc in donor livers before liver transplantation in rats[j]. transplant proc，2006，38(5)：1584-1587.
[9] massip-salcedo m， casillas-ramirez a， franco-gou r， et al.heat shock proteins and mitogen-activated protein kinases in steatotic livers undergoing ischemia-reperfusion： some answers[j]. am j pathol，2006，168(5)：1474-1485.
