作者：于丰彦，陶双友，罗琦，周福生，廖荣鑫
【摘要】 【目的】观察疏肝健脾安神和胃法组成的康泰方对肝郁脾虚腹泻型肠易激综合征(dibs)患者结肠黏膜血红素氧合酶(ho1)和一氧化氮合酶(inos) mrna表达的影响。【方法】 将63例受试对象随机分为治疗组和对照组2组。治疗组32例采用康泰方口服治疗，对照组31例采用得舒特口服治疗，2组疗程均为8周。另设15例健康体检者为正常对照组。观察治疗前后症状积分改善情况及结肠黏膜ho1和inos mrna表达的变化。【结果】 (1)治疗组治疗后各症状积分均较治疗前显著下降(p<005)，对照组治疗后除腹痛、腹胀、便溏等症状积分较治疗前显著下降(p<005)外，其他各症状积分治疗前后比较差异无显著性意义(p>005)。(2)治疗后2组的ho1平均光密度值均显著降低，inos蛋白的阳性单位均显著升高(与治疗前比较，p<005或p<001)。治疗组治疗后与正常对照组比较，差异均无显著性意义(p>005)，提示治疗组已基本恢复到正常对照组水平;而对照组治疗后与正常对照组比较，差异均有显著性意义(p<005)，提示对照组还未恢复到正常对照组水平。WWW.133229.cOm(3)治疗后2组的结肠黏膜inos基因相对表达量均显著升高，ho1基因表达量均显著降低(与治疗前比较，p<005)。2组治疗后与正常对照组比较，差异均无显著性意义(p>005)。(4)相关性研究结果表明，腹痛、腹胀、便溏和大便不尽感等主要临床症状与ho1均呈正相关，与inos呈负相关。ho1和inos之间相关系数为-0751 2，呈负相关。ho1蛋白表达量和ho1基因表达量明显相关，inos蛋白表达量和inos基因表达量也明显相关。【结论】结肠黏膜ho1和inos mrna表达异常可能是肝郁脾虚型dibs临床表现的致病机制之一，康泰方可通过上述机制改善患者的临床症状。
【关键词】 康泰方/治疗应用;肝郁脾虚;肠易激综合征/中药疗法;基因表达调控
肠易激综合征(ibs)是临床常见的胃肠功能性疾病，是一组包括腹痛、腹胀伴排便习惯改变、粪便性状异常等临床表现的症候群，持续存在或间歇发作，但无器质性疾病的证据。ibs已成为全球性的胃肠功能性疾病，其发病机制目前仍未明了。本研究观察了中药康泰方对腹泻型ibs(dibs) 证属肝郁脾虚患者的结肠黏膜血红素氧合酶(ho1)和一氧化氮合酶(inos) mrna的影响，旨在探讨疏肝健脾安神和胃法治疗dibs 的可能机制。现将研究结果报道如下。
1资料与方法
11诊断标准符合ibs诊断标准(罗马iii标准)和《中药新药临床研究指导原则》[1]及《中医病证诊断疗效标准》[2]中肝郁脾虚辨证标准及评分标准。
12排除标准①年龄在18岁以下或65岁以上;②妊娠或哺乳期妇女;③肠道器质性疾病;④严重的心脑血管系统和肝、肾、造血系统疾病以及肿瘤患者;⑤有消化道手术记录报告者;⑥严重原发性疾病及精神病患者;⑦应用可能影响胃肠道功能及内脏敏感性的药物的患者;⑧有过敏史及受试期间有药物及食物过敏者;⑨未按规定用药，无法判断疗效或资料不全等影响疗效或安全性判断者。
13一般资料选择2008年1月～2009年1月期间广州中医药大学第一附属医院门诊及住院患者中符合上述标准的合格受试者，共70例。按照随机、对照的原则，入选者的联系电话末位数属偶数者为治疗组(37例)，属奇数者为对照组(33例)，同时选取15例健康体检者设为正常对照组，全部病例均收集到结肠黏膜标本。治疗组中有5例患者失访，对照组中有2例失访，最终完成疗程的合格病例共63例，治疗组32例，对照组31例。完成疗程后再次结肠镜取标本的病例治疗组17例，对照组16例。2组患者的性别、年龄、病程等临床资料比较，差异均无显著性意义(p>005)，具有可比性。
14治疗方法治疗组采用康泰方(由白术、白芍、夜交藤等组成，广州中医药大学第一附属医院制剂)口服治疗，每次200 ml，每天2次。对照组采用得舒特(匹维溴铵片，法国苏威药厂出品)口服治疗，每次50 mg，每天3次。疗程均为8周。
15观察指标
151症状改善情况主要观察治疗前后症状积分的变化。
152对结肠黏膜ho1和inos mrna的影响经结肠镜在肠道回盲部结肠黏膜处取标本4块，其中取2块放入消毒管液氮速冻后转至-80℃低温冰箱储存备用，用于pcr检测;另2块行ho1和inos免疫组化染色。主要试剂有：ho1和inos兔抗人单克隆抗体和sabc试剂盒(武汉博士德公司产品)，pcr试剂盒(广州达晖生物技术有限公司)，引物合成和探针合成由上海英俊生物有限公司完成。检测方法：将免疫组化的标本黏膜以体积分数4%的甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，按试剂盒说明书操作步骤行免疫组化染色。逆转录—聚合酶链反应(rtpcr)的方法：(1)按试剂盒说明步骤提取标本中的mrna，在紫外/可见光分光光度计上检测吸光度(d)值，以d230、d260和d280获取样品中rna纯度和含量(μg/ml)，并计算出5 μg总rna所需用量。(2)确定inos，ho1引物为hho1 (333 bp)forward primer：5ccttcttcacct
tccccaaca3，reverse primer：5agctgagtg
taaggacccatcg3;hinos(490 bp)forward primer：5ctcccatccttgcatcctcat3，reverse primer:5cgcctcgtaaggaaatacagca3。 (3)采用rtpcr法，逆转录反应按以下条件：50℃、50 min，85℃、5 min，冰浴。离心片刻，每个反应管加入1 μl rnase h，37℃孵育20 min。(4)pcr反应条件如下：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，35个循环后72℃延伸7 min。pcr反应产物电泳鉴定：采用凝胶成像仪自带分析软件计算电泳条带的光密度(d)积分值，以样品与内参光密度积分值的比值反映各基因的表达强弱，从而对rtpcr的电泳结果进行半定量分析。
16统计学方法采用spss 80统计软件进行数据的统计分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，检验水平α=005。
2结果
212组治疗前后主要症状积分变化比较见表1。2组患者治疗前各症状积分比较，差异无显著性意义 (p>005)。治疗组治疗后各症状积分均较治疗前有显著下降(p<005);对照组治疗后除腹痛、腹胀、便溏等症状积分较治疗前有显著下降(p<005)外，其他各症状积分治疗前后比较差异无显著性意义 (p>005)。治疗后2组间比较，差异均有显著性意义(p<005)，提示治疗组在改善症状积分方面优于对照组。表12组治疗前后主要症状积分变化比较
223组治疗前后结肠黏膜ho1和inos平均光密度值比较表2结果表明：治疗前2组的ho1平均光密度值显著高于正常对照组，而inos阳性光密度值则显著低于正常对照组(均p<005)。治疗后2组ho1平均光密度值均显著降低，inos阳性光密度值则显著升高(与治疗前比较，均p<001)。治疗组治疗后ho1和inos平均光密度值与正常对照组比较，差异均无显著性意义(p>005)，提示治疗组已基本恢复到正常对照组水平;而对照组治疗后与正常对照组比较，差异均有显著性意义(p<005)，提示对照组还未恢复到正常对照组水平。表23组治疗前后ho1和inos平均光密度值比较
233组治疗前后结肠黏膜inos和ho1基因相对表达量比较见表3。治疗前2组的结肠黏膜inos基因相对表达量均显著低于正常对照组，ho1基因表达量均显著高于正常对照组(p<001)。治疗后，2组的结肠黏膜inos基因相对表达量均显著升高，ho1基因表达量均显著降低(与治疗前比较，p<005)。2组治疗后与正常对照组比较，差异均无显著性意义 (p>005)。表3 3组治疗前后inos和ho1基因表达量比较
24肝郁脾虚型dibs患者主要临床症状与结肠黏膜ho1和inos的相关性从表4中可以看出，治疗组治疗前腹痛、腹胀、便溏和大便不尽感与ho1均呈正相关，与inos呈负相关。表4肝郁脾虚型dibs患者主要症状与结肠
25肝郁脾虚型dibs患者结肠黏膜ho1与inos相关性结肠黏膜ho1与inos之间相关系数为-0751 2，呈负相关。
26肝郁脾虚型dibs患者结肠黏膜ho1和inos蛋白表达量与基因表达量相关系数及检验从表5可以看出，治疗组ho1和inos蛋白表达量与ho1和inos基因表达量明显相关。表5ho1和inos蛋白表达量与基因表达量
3讨论
肠易激综合征(ibs)是一种常见的以肠功能紊乱为主的胃肠功能性疾病，其症状主要包括腹痛、腹胀及排便习惯改变等。ibs的病因及发病机制尚未完全阐明，目前大多的观点认为ibs主要是由于胃肠道系统(肠道神经系统)与脊髓及脑(中枢神经系统)之间双向交流的通路调控紊乱而引起的。
ho1为可诱导型血红素氧合酶，是内源性一氧化碳(co)合成的主要限速酶。ho1具有抗炎、抗凋亡、抗增生作用，可在肠道应激或损伤条件下被诱导并催化血红素产生co，对动物结肠黏膜上皮细胞具有保护作用[3-4]。rattan等[5]证明选择性抑制ho系统活性将抑制胃肠道非肾上腺素能非胆碱能(nanc)神经介导的平滑肌舒张。
本实验应用rtpcr方法检测了ho1 mrna在dibs患者和正常肠组织中的表达，结果显示：ho1主要在dibs患者表达明显增高，由此我们推测：(1)dibs患者肠黏膜ho1表达增强，引起肠组织细胞内和细胞间以及血中co量的增加，可能是对肠蠕动增强的一种负反馈调节。(2)co具有扩张血管和介导细胞因子的作用，可使结肠黏膜的血管舒张，黏膜充血，增加血管和上皮的渗透性，这可能与dibs患者腹泻时血管扩张、充血渗出、腺体分泌增加有关。有研究提示内源性co的作用还与痛觉有关，抑制内源性co的生成，可以减少动物由福尔马林刺激引起的舔噬行为[6]，这或许与dibs患者的腹痛症状有关。(3)ho1的抗炎、抗凋亡、抗增生作用也是对肠道的一种保护机制。
一氧化氮(no) 是一种重要的生物信息递质，在胃肠道内广泛分布，对胃肠运动和内脏感觉起着重要的调节作用。no能神经是非肾上腺素非胆碱能神经中的重要成分之一，是介导平滑肌松弛的重要抑制性神经递质[7]，已有大量基础实验证实[8]，no对胃肠运动起抑制作用，当no含量减少时，胃肠运动加快;反之，胃肠运动减慢。
本研究发现ho1和inos在ibs患者结肠组织中的分布，dibs结肠黏膜ho1表达较正常对照组明显增高，而inos的表达较正常对照组降低;通过相关因素分析dibs结肠黏膜ho1表达与inos的表达呈负相关，并随着康泰方的干预相关性无明显变化，说明了co和inos/co均参与结肠的功能调节，它们的异常表达与结肠的功能失调有关，并初步探讨了co和no在ibs发病机制中的可能作用。
本研究还发现，肝郁脾虚型dibs的主要中医证候和症状，如腹痛、腹胀、便溏、大便不尽感与ho1的表达呈明显正相关，与结肠黏膜inos的表达呈负相关。随着康泰方的应用，肝郁脾虚型dibs的主要中医证候和症状的改善也同时伴有免疫组化检测ho1表达的明显下降和inos的升高。本研究采用rtpcr法检测肝郁脾虚型dibs治疗组和对照组治疗前后及正常对照组结肠黏膜inos、ho1 mrna的表达，从基因组学的角度探讨肝郁脾虚型腹泻型肠易激综合征的可能作用机理。研究结果提示结肠黏膜ho1和inos mrna表达异常可能是肝郁脾虚型dibs临床表现的致病机制之一，康泰方可能通过上述机制改善患者的临床症状。
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