作者：林一峰，梁祖建，何铭涛
【摘要】 【目的】 探讨组织蛋白酶k(cathepsin k，ck)在骨质疏松症发病中的意义，观察补肾通络方对去卵巢大鼠破骨细胞ck表达的影响。【方法】选用30只雌性sd大鼠随机分成3组：假手术组、模型组及补肾通络方组(中药组，剂量为1246 g·kg-1·d-1);后2组切除双侧卵巢，4周后中药组给予补肾通络方灌胃。分别于第6、12周测定各组大鼠全身骨密度(bmd)，并采用western blot及逆转录—聚合酶链反应(rtpcr)法测定体外分离培养破骨细胞中ck的蛋白及基因表达。【结果】 体外分离培养椎骨来源的破骨细胞具有成熟破骨细胞的表型特征，去卵巢模型大鼠骨密度在时效上与ck的表达呈现负相关;补肾通络方以时效方式下调 ck蛋白及ck mrna的表达水平(均p<005)。【结论】 ck的过度表达是导致骨密度下降的重要原因，是骨质疏松症发生的潜在危险因子;以时效方式下调 ck蛋白及ck mrna的表达进而治疗骨质疏松症可能是补肾通络方的作用机制之一。
【关键词】 骨质疏松症/中药疗法;补肾通络方/药理学;组织蛋白酶k;破骨细胞/病理学;疾病模型，动物;大鼠
骨质疏松症(osteoporosis，op)是以骨量减少，骨组织微细结构退化，骨强度下降，骨折危险性增加为特征的一种全身性的骨代谢疾病。Www.lw881.com研究表明，组织蛋白酶k(cathepsin ck)在破骨细胞中选择性、特异性地表达，参与骨吸收的重要调节[1]。ck 是防治op的一个非常重要的靶点，其选择性地在破骨细胞引起的骨吸收中起特殊的作用[2]。本研究拟探讨补肾通络方对去卵巢大鼠破骨细胞ck表达的影响，现报道如下。
1材料与方法
11动物6月龄清洁级雌性 sd 大鼠，体质量 190～240g，购于广州中医药大学实验动物中心(合格证号：0058908)。所有大鼠自由摄食和饮水，保持室温18℃～22℃，相对湿度40%～60%，自然光照。
12药物补肾通络方由杜仲10g，龟板30g，当归15g，熟地10g，鸡血藤10g等12味中药组成(药材由广州中医药大学附属骨伤科医院药房提供，经药剂科鉴定均为纯正药材)。将中药制成粗粉，煎煮2次，合并2次药液过滤，用旋转蒸发仪将药液浓缩至含生药量143g/ml。药液常温冷却后，置4℃冰箱内保存备用。
13主要试剂及仪器αmem培养基及胎牛血清(fbs，美国gibcol 公司)，聚偏氟乙烯(pvdf)膜(biorad公司)，超敏发光液(北京利莱公司)，trizol总rna提取试剂(美国invitrogen公司)，sf300塑料薄膜封口机(温州兴业公司)，co2培养箱(德国heraeus公司)，倒置相差显微镜(日本olympus公司)，swcjif超净台(苏州净化设备有限公司)，tgl18r冷冻离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)，dyy2c型电泳仪、迷你型垂直电泳槽、半干转移槽(北京六一仪器厂)，精密天平(瑞典ohaus 公司)，gene amp 2400 pcr扩增仪(美国invitrogen公司)，双能x线吸收测量仪(美国lunar公司)。
14模型复制[3]、分组及给药所有大鼠随机分为假手术组、模型组及补肾通络方组(中药组)，每组10只。各组大鼠按33ml/kg腹腔注射100mg/l水合氯醛溶液，10min后麻醉成功，将大鼠俯卧位固定，无菌操作，背侧切口，模型组和中药组在无菌条件下手术切除双侧卵巢后缝合，假手术组不摘除双侧卵巢，仅切除卵巢周围少量脂肪组织。手术结束后，每只动物皮下注射青霉素抗感染3d，所有动物在20℃～25℃、湿度55%～70%，通风良好的spf级动物房饲养。造模4周后，假手术组、模型组给予自来水灌胃，中药组灌胃给予补肾通络方中药，剂量为1246g·kg-1·d-1。
15大鼠骨密度(bmd)测定分别于第6、12周，各组大鼠按33ml/kg腹腔注射100mg/l水合氯醛溶液腹腔麻醉后，四肢展开平置于双能x线吸收测量仪平台上，通过计算机系统中小动物软件测定全身bmd。
16破骨细胞的培养[4]将大鼠断颈处死后，在无菌条件下分离腰椎(l1~5)，体积分数75%的酒精浸泡1min，在4℃dhanks平衡盐溶液中清除骨表面的软组织、骨膜后，用4℃αmem冲洗液冲洗2次，在培养皿中剪碎骨组织，加10mlαmem冲洗液一起转移入ⅰ号离心管，在漩涡振荡器上振荡5s，静置7s，将上层细胞悬液经细胞筛网过滤到ⅱ号离心管中，去掉骨碎片，然后再加入10mlαmem培养液入ⅰ号离心管振荡，将上层细胞悬液经细胞筛网过滤到ⅱ号离心管中，重复上述步骤3～4次，收集细胞悬液。将所收集的细胞悬液在离心机上离心10min，4℃、2000r/min，弃上清，沉淀中加入破骨细胞诱导液，用吸管轻轻吹打混匀。以血细胞计数器计数，使悬液含细胞数为15×106个/ml，分别加入预置小牛骨片(厚约60μm)的24孔板、预置盖玻片的6孔培养板内，置37℃，含体积分数5%c02的空气，饱和湿度的孵箱中培养，24h后换破骨细胞诱导液1次。
17破骨细胞的鉴定[5] (1)形态学观察：倒置相差显微镜观察培养破骨细胞的形态，苏木素—伊红(he)染色，光镜观察;甲苯胺兰染色，光镜观察。(2)抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色：将破骨细胞爬片用磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗3次，再置入体积分数25%戊二醛固定液中，4℃、固定15min，pbs冲洗3次，放入trap染色液中，37℃温育1h。取出破骨细胞爬片，双蒸水冲洗3次，晾干，中性树胶封片，光镜观察。
18western blot检测ck蛋白表达水平适时抽提破骨细胞蛋白，取蛋白样品20μl，加2倍上样缓冲液20μl，100℃煮3min，离心5min，取上清15μl上样，进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度50g/l，分离胶浓度100g/l，于200v进行电泳45min。完整将分离胶取下，于转移缓冲液中静置30min后，转移夹靠pvdf膜，排除气泡，以31ma转移60min。取出pvdf膜，在tristween盐缓冲液(ttbs)中摇5min，用封闭液(含50g/lnon fat dry milk)室温封闭2h，加1∶500稀释的一抗(ck、βactin)，4℃过夜，次日用tbst(20mmol/ltrishcl，ph 75;015mmol/lnacl;05 g/ltween 20)洗pvdf膜3次，然后加1∶1000二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg)，室温反应1h。用tbst洗3次，加10ml的增强化学发光显色试剂(lumi glotm)室温下轻摇1min，排去液体，以保鲜膜包裹，用x线光片在增感屏中紧密接触，使x线光片感光1min，显影，定影，冲洗，晾干，拍照。采用band scan 50凝胶图像分析软件分析光密度值，以ck/βactin光密度比值来表示ck蛋白表达水平。
19逆转录一聚合酶链反应(rtpcr)法测定ck基因的表达收集培养稳定后的破骨细胞，总rna提取按照trizol试剂盒说明书进行，以此rna为模板，进行逆转录反应合成cdna，取上述cdna5μl进行pcr扩增，引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。ck基因上游引物：5cagcttccccaagatgtgat3，下游引物：5tggaggactccagcgtctat3;gapdh上游引物：5tggtctacatgttccagtatgact3，下游引物：5ccatttgatgttagcgggatctc3，反应条件：94℃ 变性5min;94℃、30s，57℃、30s，72℃、30s，共32个循环; 72℃延伸 5min，凝胶扫描成像系统记录电泳结果。 采用band scan 50凝胶图像分析软件分析光密度值，以ck/gapdh光密度比值来表示ck mrna表达水平。
110统计学方法应用spss 130医用统计软件包进行数据统计学分析。
2结果
21各组不同时间点bmd值比较表1结果显示：不同时间点模型组bmd较假手术组显著降低，差异均有显著性意义(p<001)，说明造模成功。中药组bmd较模型组显著增加(均p<005)，且中药组骨密度术后12周较术后6周显著增加，差异有显著性意义(p<005)，说明中药补肾通络方能提高骨密度。
22破骨细胞的鉴定图1(彩图见第439页)结果显示：倒置相差显微镜下观察，骨髓细胞悬液培养30～40min即可见破骨细胞贴壁，细胞逐渐伸展，开始时夹杂有较多血细胞、单核细胞、成熟破骨细胞、骨髓间质细胞等，随着培养时间延长及换液，造血细胞和大部分基质细胞被冲洗掉，而遗留下贴壁较牢的破骨细胞、单核细胞。破骨细胞较其他细胞胞体大，形态不规则，呈油煎蛋形、长条形、腊肠形或漏斗形等，细胞边缘有许多明显的细小丝状伪足伸出，细胞内可见几个到几十个不等的核，胞浆内可见大小不等的空泡。he染色标本可见多核的破骨细胞，细胞核呈圆形或椭圆形，染色质颗粒细小，分布均匀，每个核含2～4个核仁，胞浆伸出片状伪足样突起。甲苯胺兰染色后，可见破骨细胞特有的亮区结构。trap染色后可见特异的trap染色酶活性部位呈红色阳性颗粒，分布于破骨细胞胞浆内，核不着色为阴性。表1各组不同时间点bmd值比较(x±s)
23各组不同时间点ck蛋白表达水平比较图2、图3结果显示：不同时间点假手术组ck蛋白表达最弱，模型组ck蛋白表达显著增强(均p<001)，中药组可显著下调ck蛋白表达水平(均p<005)，且呈一定的时间效应关系。
24各组不同时间点ck基因表达水平比较图4、图5结果显示：不同时间点假手术组ck基因表达最弱，模型组ck基因表达水平显著增高(均p<001)，中药组可显著下调ck基因表达水平(均p<005)，且呈一定时间效应关系。
统计方法：单因素方差分析;①p<001，与假手术组比较;②p<005，与模型组比较;③p<005，与术后6周比较
3讨论
op发生的微观学机制是破骨细胞的骨吸收作用与成骨细胞的骨形成作用失耦联，即骨吸收大骨形成最终导致了骨质与骨量的下降[6]。在一项确定ck功能的研究中，通过检测致密性骨发育不全患者的ck基因，发现该类患者的ck基因发生了突变[7]。另一项研究发现ck缺陷显性的小鼠由于破骨细胞介导的骨基质降解的减少而引起骨骼石化症，同时也证明了该酶在脾、肝、肌肉和肺组织中并没有高表达[8]。通过对ck敲除小鼠骨吸收部位的组织学分析发现破骨细胞分化良好且能使细胞外基质脱矿化，但是基质降解不充分，这表明ck主要在骨吸收中发挥降解骨基质的作用[9]。在治疗op等骨基质代谢异常的相关疾病中，特别是骨基质过度降解症中，组织蛋白酶k是个重要的靶标，这为op等骨质减少性疾病的防治药物研究提供了新思路。
传统中医学虽无“骨质疏松症”这一明确名词，但有类似本病的记载，究其病因病机及临床症状，与“骨痿”、“虚劳”、“骨痹”之论述颇为相似，其中定性、定位较准确的是“骨痿”[10]。长期以来，本课题组对骨质疏松症进行了较为深入的研究，将骨质疏松症的病机特点概括为多虚、多瘀、多因、多果、多系统、多脏器的全身性骨骼疾病。多虚是指肾虚、脾虚，气、血、精、津液等物质不足，无力濡养肌肉筋骨，骨枯髓减，经脉失荣，而致腰脊等骨骼酸痛乏力，甚则畸形、骨折。多瘀乃因虚致瘀，血瘀则气血周行不畅，营养物质不能濡养脏腑，引起脾肾俱虚而加重症状。多因是指骨质疏松症的发生与多种因素有关，既可原发得病又可以继发于他病之后，病因复杂。多果指骨质疏松症的发展和转归不一，骨质疏松性骨折后的并发症较多，甚至可以危及生命。因此，我们确立了补肾通络的原则，拟定了补肾通络方，取得了较好的临床疗效，但其深层作用机制仍有待阐明。
本研究检测去卵巢模型大鼠6周、12周时发现，随着骨密度的下降，分离培养的破骨细胞的ck蛋白及ck mrna表达均升高，在时效上呈现负相关关系，结合前期的研究及ck基因在介导破骨细胞骨吸收中的作用，可推测ck的过度表达是导致骨密度下降的重要原因，是骨质疏松症发生的潜在危险因子。另外，western blot及rtpcr的结果表明，补肾通络方能以时效依赖的方式下调 ck蛋白及ck mrna 的表达(p < 005)。综上所述，以时效方式下调 ck蛋白及ck mrna 表达进而治疗骨质疏松症是补肾通络方的作用机制之一。
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