作者：李敏，徐国峰，万赖思琪
【摘要】 【目的】探讨电针对血管性痴呆(vd)大鼠长时程增强效应(ltp)及钙调蛋白(cam)、钙调蛋白依赖性蛋白激酶 ⅱ (campk ⅱ) mrna表达水平的影响。【方法】将70只sd大鼠，除正常组、假手术组各14只外，其他经改良4vo法造模成功后36只分为电针组、西药组、模型组各12只。电针组针刺百会、大椎、肾俞穴，西药组给予尼莫通12 mg·kg-1·d-1，其他3组不予任何治疗。观察各组大鼠morris水迷宫逃避潜伏期、各象限平台跨越次数，活体海马ltp实验结果及神经元cam、campk ⅱ mrna表达水平。【结果】与模型组比较，电针组和西药组逃避潜伏期显著缩短，跨越原平台及左侧平台次数增加，ltp幅值升高，持续时间延长，cam、campk ⅱ mrna表达水平显著升高(均p<005)。【结论】电针有效提高vd大鼠学习与记忆能力的作用可能与其能提高ltp反应幅值及持续时间，提高cam、campk ⅱ mrna表达水平有关。
【关键词】 血管性痴呆/针灸疗法;疾病模型，动物;大鼠;穴，百会;穴，大椎;穴，肾俞
血管性痴呆(vascular dementia,vd)主要是由于脑血管因素引起的脑组织血液循环障碍，脑部机能减退而导致的一种认知功能缺损的综合征[1]。wWW.133229.COm长时程增强效应(longterm potentiation，ltp)与学习记忆关系密切，多数影响ltp的因素对学习记忆有影响，一些影响学习过程的因素也影响ltp，而ltp的诱导可加速学习过程，学习过程可以促使ltp产生[2]。神经元内游离钙离子浓度[ca2+]i及其与钙调蛋白(cam)、钙调蛋白依赖性蛋白激酶ⅱ(campk ⅱ)的级联反应参与了学习、记忆的形成[3]。本实验结合morris水迷宫，选择ltp以及cam、campkⅱmrna表达水平作为检测指标，以探讨电针治疗vd大鼠的神经电生理及分子生物学水平的机理。现报道如下。
1材料与方法
11动物健康成年sd大鼠70只，雌雄各半，2月龄，体质量180～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：scxk(粤)20080020。
12主要试剂及仪器逆转录—聚合酶链反应(rtpcr)试剂盒(toyobo公司)，pcr试剂盒(深圳中晶公司)，引物(invitogen合成)，尼莫通(德国拜耳，批号：116530)。sdq30双极射频电凝器(上海手术器械厂) ，morris 水迷宫(实验室自备)，g68051型电针仪(青岛鑫升公司)，smuppc生物信号处理系统(中山大学医学院)，7300型实时荧光定量pcr(real time pcr)仪(美国abi公司)。
13模型复制采用4血管阻塞法(4vessel occlusion， 4vo)法[4]，参照文献[5]稍加改进复制vd模型大鼠。
14分组及治疗选用sd大鼠70只，除正常对照组、假手术组各14只外，其他大鼠均采用改良4vo法造模，将36只成活大鼠分为电针组、西药组、模型组各12只。术后15 d，vd大鼠刀口完全愈合，饮食正常，体质量恢复后开始治疗。电针组选取临床治疗脑病常用有效穴“百会”、“大椎”、“肾俞”，以华佗牌05寸毫针于大鼠头部“百会”斜刺05寸、“大椎”穴直刺05寸、“肾俞”穴直刺05寸[6]，连接电针仪，施以疏密波，频率150 hz，强度以大鼠安静耐受为度(约20 ma)，每天按时电针1次，留针30 min。西药组大鼠给予尼莫通12 mg·kg-1·d-1，均连续治疗15 d。正常对照组、假手术组和模型组只在同等条件下饲养，不予任何治疗。
15morris水迷宫测试参照morris水迷宫法[7]进行测试。
16ltp实验
161手术以200 mg/l乌拉坦(75ml/kg)腹腔注射麻醉,行气管插管，将大鼠固定于脑立体定位仪上。在颅骨上定位刺激电极和记录电极插入部位(刺激电极：囟后42 mm、中线旁开38 mm，记录电极：前囟后34 mm、中线旁开25 mm)，环钻开颅，暴露两电极插入部位的脑皮层，并剥去硬脑膜。
162群体峰电位(ps)记录参照大鼠脑立体定位图谱，再次定位刺激电极、记录电极进入部位(刺激电极：囟后42 mm、中线旁开38 mm，记录电极：前囟后34 mm、中线旁开25 mm)，分别先后插入刺激电极和记录电极(深度均为24~30 mm)，反复调整电极深度记录最大的诱导电位。
163ltp的诱导记录单个刺激(波宽02 ms，每次间隔15 s，强度为引起最大群体电位的50%)所诱导的电位，直到同样刺激大小下，诱导电位幅值持续稳定15 min,每5 min记录1次峰电位幅值(psa)，取3次psa平均值作为基线值(100%)，同时记录刺激强度大小。稳定记录15 min后给予高频刺激(hfs，100 hz、波宽02 ms，4串刺激,每串50个刺激，每串间隔10 s，刺激强度为诱导电位最大值的75%所对应的刺激强度)。hfs后用上述单个刺激进行检测(波宽02 ms，每次间隔15 s，强度为引起最大群体电位的50%)，并观察持续时间，测量psa及峰潜伏期，psa增大超过20%并持续30 min以上者可视为产生了ltp[8]。采样信号经smuppc生物信号处理系统显示、平均叠加，记录、处理。hfs后psa用百分比表示(原基线值为100%)。对实验过程中脑大量出血、电极位置超出范围者不统计。
17大鼠海马cam、campkⅱ mrna表达水平检测水迷宫测试结束后，立即断头处死大鼠，在冰台上迅速取出海马组织，放入trizol中，储存于-80℃冰箱中。按说明提取总rna，采用rtpcr试剂盒进行逆转录得到cdna后，以其为模板加入引物、pcr试剂，实时荧光定量pcr仪进行定量，分别对cam和campkⅱ进行pcr扩增，gapdh为内参照。利用美国pe公司引物设计软件primer express设计基因专一性引物。cam引物序列为：上游: ctaagcccttctgcacatctacac;下游：aactccacacttcaacagcaacat;以gapdh为内参，序列为：上游：ctgagcactctc cctcacaattc;下游：tgcagcgaactttattga tggtat;campkⅱ序列为：上游：gagagca ccaacaccaccatc下游：aaagtctccattgctta tggcttc。
18统计学方法数据采使用spss 130软件统计包完成。计量资料采用单因素方差分析，组间均值两两比较采用snk法，同组自身前后比较采用配对t检验，检验水平α=005。
2结果
21水迷宫实验在morris水迷宫试验中，各组大鼠的平均潜伏期及空间探索指标，假手术组与正常组比较差异无显著性意义(均p>005);与假手术组比较，模型组大鼠平均逃避潜伏期显著延长(p<005);电针组和西药组大鼠平均逃避潜伏期与模型组大鼠比较显著缩短(均p<005)。假手术组大鼠在原平台象限跨越相应平台次数显著多于其他3个象限(p<001)，而模型组在原平台象限跨越相应平台次数与其他3个象限比较差异无显著性意义(p>005)。与假手术组大鼠在原平台象限跨越相应平台次数比较，模型组大鼠的跨越次数显著减少(p<001)。电针组与西药组大鼠在原平台象限跨越相应平台次数显著多于其他3个象限(均p<001)，且跨越原平台和左侧平台次数较模型组大鼠显著增多(均p<005)。提示模型组大鼠学习记忆能力较差，4vo法造模成功，电针和西药均能改善模型大鼠的学习巩固和再现能力(见表1、表2)。表1各组大鼠平均逃避潜伏期比较(x±s)
22电针vd大鼠对ltp的影响正常组、假手术组大鼠均产生了ltp，维持时间较模型组显著延长(p<005)，电针组与西药组比较差异无显著性意义(p>005)，模型组与针刺组、西药组比较差异具有显著性意义(p<005)，各组psa及ltp持续时间见表3、图1。表3各组psa及ltp持续时间比较
23各组 cam、campkⅱ mrna表达水平
real time pcr图谱完整，溶解曲线分析峰型单一，无引物二聚体和非特异性扩增(图2，彩图见第437页)。
表4结果显示：模型组大鼠海马cam、campkⅱ mrna表达水平较假手术组显著降低(均p<005)，与模型组比较，电针组和西药组的cam、campkⅱ mrna表达水平均显著增高(p<005)。表4各组cam，campkⅱmrna表达水平比较
3讨论
morris水迷宫是公认的较客观准确的实验动物空间记忆检测方法[9]。ltp被认为反映了突触水平的记忆过程[10]，由于其检测的是神经电生理改变，结果可以直观测量和以图像保存，避免了人为因素干扰,便于对试验因素控制，所以更加可靠。ltp一般分为诱导和维持2个阶段。由于ltp是发生在突触部位的功能改变，所以其形成机制研究主要是探讨参与其形成或调节的各种分子，包括参与形成的神经递质和受体，细胞内的信号转导机制，参与调节的神经递质、激素等[11]。一些损害学习记忆的因素如缺血可降低或阻断ltp的形成，减弱ltp[12]，引起学习记忆功能的障碍，也很容易造成海马的损伤。因此本研究把行为学测定的morris水迷宫实验和神经电生理学测定的ltp结合起来作为检测学习记忆能力的方法。通过改良4vo法复制大鼠脑区缺血缺氧的vd模型，结合morris水迷宫和ltp实验分组比较发现电针组和西药组大鼠在强直刺激ltp引出后持续时间较模型组延长，与正常组、假手术组比较无显著差异。从psa的变化可以看到正常组及假手术组的电位差最大，西药组次之，其次是针刺组，模型组居后，可推测在假手术组大鼠神经细胞中的电信号要比其他3组强，西药组优于针刺组，模型组电信号最差，同时证明ltp是学习与记忆的生理机制之一，为电针治疗vd实验研究提供了新的思路。
前期研究表明，vd发病与神经元凋亡有关。电针可通过抑制神经元凋亡和坏死，保护缺血损伤后的皮质和海马神经元，从而改善vd大鼠的学习记忆障碍[13-14]。而另一方面，神经元内游离[ca2+]i及其与cam、campkⅱ的级联反应参与了学习、记忆的形成[3]，[ca2+]i作为胞浆第二信使，与cam结合形成ca2+cam复合物后，进一步激活campkⅱ，而campkⅱ被认为是一个分子开关，在静息状态时，存在自身抑制区封闭催化部位而处于非活化状态;但当神经元受刺激时，ca2+cam复合物与campkⅱ的自身抑制区结合，改变此酶的构象，从而具有活性;并且campkⅱ迅速发生自身磷酸化，转变为非ca2+依赖状态[15]，此自身磷酸化可使campkⅱ保持先前激活ca2+信号的信息，故被认为是记忆形成和存储的分子机制之一[16]，这个观点的提出为vd的研究开辟了新的领域。在以往的工作基础上，本实验进一步观察电针对cam、campkⅱmrna异常改变的影响，结果表明，电针可提高神经元内cam、campkⅱ mrna表达水平，与西药组作用相仿，并与ltp诱导检测结果一致。
综上所述， ltp是学习与记忆的电生理基础机制之一，其诱导过程离不开cam、campkⅱ的参与，电针可改善ltp，并通过调节大鼠海马神经元内cam、campkⅱ mrna级联反应的异常改变，进而改善morris水迷宫测试指标和ltp，增强大鼠学习记忆能力，达到治疗vd的目的。
【参考文献】
[1]o’brien， john t.vascular cognitive impairment [j].lancet neurol，2003，2(2):89.
[2]韩济生，关新民.医用神经生物学[m].武汉:武汉出版社，1996：229.
[3]watson j b，khorasani h，persson a，et al. agerelated deficits in longterm potentiation are insensitive to hydrogen peroxide:coincidence with enhanced autophosphorylation of ca2+/calmodulindependent protein kinase ⅱ[j].j neurosci res，2002，70(3):298.
[4]李兵，章翔，蒋晓帆,等.4vo造模改良四血管阻塞法建立大鼠全脑缺血模型[j] .中华神经外科疾病研究杂志，2005，4(2)：110.
[5]李敏，张正，徐国峰.电针对血管性痴呆大鼠脑细胞凋亡和血红素氧化酶的影响[j].江苏中医药，2006，27(4)：46.
[6]华兴邦，李辞蓉，周浩良,等.大鼠穴位图谱的研制[j].实验动物与动物实验，1991，1：1.
[7]morris r g, garrud p , rawlins j n p , et al. place navigation impaired in rats with hippocampal lesions [j] . nature , 1982 , 297 : 681.
[8]郑敏，宗贤刚，郭莲军,等.gaba及受体拮抗剂对大鼠海马ca3区长时程增强效应的影响[j].中国药理学通报，2006，22(12)：1457.
[9]赖新生，李敏，徐国峰.电针对血管性痴呆大鼠学习记忆和血红素氧化酶的影响[j].广州中医药大学学报，2005, 22(6):445.
[10]morris r g.elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas [j].eur j neurosci,2006，23:28
[11]韩太真.突触可塑性与长时程增强现象的研究进展[j].西安交通大学学报，2005，26(4)：305.
[12]sabrina wang, nohjin kee, edward preston.electrophysiological correlates of neural plasticity compensating for ischemiainduced damage in the hippocampus[j].experimental brain research，2005，165:250
[13]徐国峰，李敏.电针对vd大鼠脑神经元ho、bcl2和bax蛋白表达影响研究[j].辽宁中医药，2006，33(11)：1510.
[14]李敏，徐国峰.电针对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡相关蛋白bcl2、bax和ho1的影响[j].中华中医药杂志，2006，21(8)：502.
[15]solac，barrons，tusell j m，et al.the ca2+/calmodulin system in neuronal hyperexcitability[j].biochem cell biol，2001，33(5):439.
[16]hudmon a，schulman h.structurefunction of the multifunctional ca2+/calmodulindependent protein kinase ⅱ[j].biochem j，2002，364(3):593.
