作者：李齐欢，万新祥，张继平
【摘要】 【目的】 探讨补阳还五汤对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力的影响及其可能的作用机制。【方法】选用spf级sd大鼠，采用双侧颈总动脉结扎法复制慢性脑缺血大鼠模型，再将经morris水迷宫筛选的合格模型动物随机分为模型组，金纳多组(剂量为45 mg·kg-1·d-1)，补阳还五汤高、低剂量组(中药高、低剂量组，剂量分别为40、20 g·kg-1·d-1)，并与假手术组进行对照，检测各组大鼠的学习记忆能力及脑组织中血小板活化因子(paf)含量。【结果】在morris水迷宫定向航行实验中，给药各组第1天及中药低剂量组第2、3天逃避潜伏期明显缩短，与模型组比较差异均有显著性意义(p<005);在空间探索实验中，中药各组穿越平台次数均有增加，但与模型组比较差异无显著性意义(p>005);模型组脑组织paf含量与假手术组比较显著升高(p<005)，各给药组脑组织paf含量显著降低(与模型组比较，p<005)。【结论】补阳还五汤能明显改善慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力，其作用机制可能与降低脑组织中paf含量有关。Www.133229.CoM
【关键词】 补阳还五汤/药理学;脑缺血，慢性/中药疗法;疾病模型，动物;大鼠
补阳还五汤主要用于中风之气滞血瘀证，临床研究证实其疗效确切[1]。近年来，不少学者对该方作用机理做了大量实验研究及临床研究，证明其在缺血性脑损伤、脊髓及周围神经损伤方面有着广泛的应用价值[2-3]，但对慢性脑缺血损伤后学习记忆能力的影响尚未见报道，本实验观察了补阳还五汤对慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力及脑组织血小板活化因子(platelet activating factor,paf)含量的影响，以探讨其治疗缺血性脑血管病的可能作用机制。现报道如下。
1材料与方法
11主要试剂与仪器金纳多片(40 mg/片)由德国威玛舒培博士药厂生产，大鼠paf酶联免疫吸附反应(elisa)试剂盒(批号：02070901)由广州市达晖生物科技有限公司提供，灭菌结晶磺胺(批号：081114)由安徽新世纪药业有限公司生产，肝素钠注射液(批号：0705102)由江苏万邦生化医药股份有限公司生产。jlbehvmmmg水迷宫由上海吉量软件科技有限公司提供，201酶标仪由美国sigma公司生产。
12药物与制剂补阳还五汤饮片颗粒剂水溶液按《医林改错》原方中所载的药味用量制备。处方：生黄芪120 g，当归尾6 g，赤芍45 g，地龙、桃仁、红花、川芎各3 g。取相当于饮片等量的各味药颗粒剂(由广东一方制药有限公司提供)混合后，用100℃蒸馏水配制成补阳还五汤水溶液备用。
13动物spf级sd大鼠，雄性，体质量180~220 g，广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：scxk(粤)20080020。
14大鼠慢性脑缺血模型复制[4]大鼠禁食12 h(禁食不禁水)后，经水合氯醛麻醉(035 g/kg)，腹腔注射后，将大鼠仰卧固定于手术台上，颈部皮肤剪毛备皮，碘酒、体积分数75%乙醇消毒，颈前正中切开皮肤及皮下组织，长度约15 cm，在颈前肌肉和侧方肌肉间隙分离双侧颈总动脉、迷走神经，双重丝线结扎双侧颈总动脉，缝合，伤口撒磺胺灭菌粉预防感染。假手术组不做结扎其他步骤同造模组。
15分组与给药大鼠术后3周进入慢性缺血期，因此在术后4周进行morris水迷宫初筛，根据水迷宫筛选结果按完全随机法分为5组，即假手术组(给予等容积的生理盐水)、模型组(给予等容积的生理盐水)、补阳还五汤低剂量组(中药低剂量组，剂量为20 g·kg-1·d-1)、补阳还五汤高剂量组(中药高剂量组，剂量为40 g·kg-1·d-1)、阳性对照组(金纳多组，剂量为45 mg·kg-1·d-1)，每组10只，连续给药4周。
16morris水迷宫实验[5]水迷宫为一直径12 m、高05 m的圆形水池，划为4个象限，用黑色漂浮聚乙烯小球覆盖整个液面，将直径11 cm、高25 cm的圆形平台固定于某一象限，平台隐于水平面下1 cm，水温控制于22℃~25℃。
定位航行试验(place navigation test,pnt)：用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的能力。实验历时5 d，每天训练1个循环，每个循环训练4次。训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(逃避潜伏期，escape latency)。4次训练大鼠分别从4个不同的入水点入水，如果大鼠在120 s内未找到平台，需将其引至平台，使其在平台上熟悉30 s，这时潜伏期记为120 s，2次训练间隔60 s。整个实验过程中，水池周围参照物(迷宫外线索)保持不变，同时实验者不能在动物视力范围。
空间搜索试验(spatial probe test,spt)：用于测量大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的能力。即在第5天时，撤除平台，然后任选2个入水点将大鼠面向池壁放入水中，利用morris水迷宫图像自动采集和处理系统记录大鼠在120 s内穿过原平台所在位置的次数。
17脑组织paf测定给药结束后取各组大鼠脑组织额叶皮层，按质量比1∶9加生理盐水做成匀浆，5 000 r/min离心10 min，取100 μl上清于反应板中，混匀30 s，封住板孔，37℃温育90 min后甩尽液体，洗涤液反复洗涤5次后拍干，加入生物素(biotin)，混匀30 s，封住板孔，37℃温育60 min后甩尽液体，洗涤液反复洗涤5次后拍干，加入辣根过氧化物酶(hrp)，封住板孔，37℃温育30 min后甩尽液体，洗涤液反复洗涤5次后加入显色液，混匀10 s，37℃暗处温育15 min后加入终止液，混匀30 s，在450 nm处读光密度(d)值。
18统计学方法采用spss 130统计软件进行数据的统计分析。
2结果
21各组对慢性脑缺血大鼠morris水迷宫实验的影响随着训练的进行，定位航行实验中各组动物寻找平台的逃避潜伏期逐渐缩短。模型组与假手术组比较，在训练的第1~3天逃避潜伏时间差异有显著性意义(p<005);与模型组比较，中药高剂量组和金纳多组逃避潜伏期在第1天、中药低剂量组在第1~3天差异均有显著性意义(p<005)，提示各给药组能改善造模后大鼠的学习和记忆能力，结果见表1。在空间搜索试验中，模型组，中药高、低剂量组以及金纳多组的穿越平台数分别降至假手术组的4246%、5616%、6438%、7671%，其中模型组与假手术组比较差异有显著性意义(p<005)，中药高、低剂量组与模型组比较差异无显著性意义(p>005)，金纳多组与模型组比较差异有显著性意义(p<005)，结果见表2。表1各组对慢性脑缺血大鼠定位航行试验的影响表2各组对慢性脑缺血大鼠空间探索试验的影响(x±s)
22各组对慢性脑缺血大鼠脑组织paf含量的影响表3结果显示：与假手术组比较，模型组脑组织paf含量显著升高(p<005);与模型组比较，中药高、低剂量组和金纳多组脑组织paf含量显著降低(p<005)。表3各组对慢性脑缺血大鼠脑组织paf的影响
3讨论
脑缺血是神经系统的一种常见病理状态。多年来，人们对脑缺血的研究主要集中在急性脑缺血，但对慢性脑缺血所致脑损害的特点、机制和防治的了解还不够清楚。慢性脑缺血或脑灌注不足伴发于脑动脉硬化、血管性痴呆、阿尔茨海默病(alzheimers disease,ad)、binswanger病和动静脉畸形等多种脑血管疾病的病理过程中，发病早期以认知功能损害为主要表现，最终可能导致持久或进展性认知与神经功能障碍[6]。
paf是一种由多种类型细胞释放、能诱发多种生物学效应的磷脂类物质，作为一种强效炎症介质，参与多种炎性病理生理反应，在炎症、休克和过敏性疾病中发挥重要的病理作用[7]。临床资料显示，ad患者血浆中paf水平与其认知障碍程度之间存在显著相关性[8]。越来越多的资料也表明，paf可能参与了ad、朊粒病(prion disease)和其他神经退行性疾病的神经病变，该作用可能涉及不同的机制，包括增加ca2+内流、促进突触前谷氨酸释放[9]、促进神经元内前列腺素产生[10]、或通过nmda受体no信号通路[11]。paf可作为介导小胶质细胞激活的关键因子加重脑内慢性炎症反应[12]。morris水迷宫试验是英国心理学家morris于20世纪80年代初设计并应用于检测学习记忆能力的方法。本文利用该实验进行慢性脑缺血对大鼠学习记忆能力损伤的比较，并检测慢性脑缺血大鼠脑组织中paf含量，探讨大鼠学习记忆功能与脑组织中paf含量的相关性，以及补阳还五汤改善脑缺血大鼠学习记忆能力的作用机制。
本研究结果显示，慢性脑缺血模型大鼠脑组织中paf含量与假手术组比较显著性升高，表明paf可能为慢性脑缺血大鼠中枢神经细胞损伤的重要因子。补阳还五汤是补气行瘀、疏通经络的代表方剂，广泛应用于心脑血管疾病的治疗，方中各单味药的活性成分如川芎中的川芎嗪、红花中的红花黄色素、当归中的阿魏酸、赤芍中的赤芍苷等，均可阻断paf的合成代谢及受体活性而发挥生物拮抗效应[13-16]。
综上所述，补阳还五汤可抑制慢性脑缺血大鼠脑组织中的paf含量升高，其作用与改善慢性脑缺血大鼠学习记忆能力的减退作用一致，提示其改善慢性脑缺血大鼠学习记忆能力的作用可能与降低脑组织中paf含量有关。
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