【摘要】 【目的】提高青蒿素抗肿瘤效率，阐明青蒿素增敏复方的抑瘤增敏机理。【方法】采用四甲基偶氮唑盐(mtt)法测定各药物对人肝癌细胞株hepg2细胞的生长抑制率;经皮下接种hepg2细胞进行荷瘤裸鼠造模，测定给药15 d后瘤体质量，计算抑瘤率。【结果】青蒿琥酯配伍马来酸二乙酯、巯基琥珀酸和氨基三唑后，肿瘤细胞的生长抑制率较相同浓度的青蒿琥酯单方高4384%，抑瘤率较青蒿琥酯单方提高近3倍。hepg2细胞中抗氧化剂含量及抗氧化酶活性测定结果表明，空白组的测定值均高于单方组和复方组，而复方组的测定值低于单方组。【结论】青蒿素增敏复方可能通过降低抗氧化剂含量及抑制抗氧化酶活性发挥抗肿瘤增敏作用。
【关键词】 青蒿素/药理学;肿瘤/中西结合疗法;增敏;细胞培养;疾病模型，动物;裸鼠
青蒿素是从中药青蒿(artemisia annua l.)中提取的抗疟倍半萜过氧化内酯，其人工半合成衍生物青蒿琥酯、双氢青蒿素、蒿甲醚等已广泛用于疟疾治疗。在青蒿素抗疟研究中发现，阿霉素、维生素b2和甲萘酯等自由基引发剂(促氧化剂)与青蒿素有协同抗疟作用，而生育酚、抗坏血酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等自由基清除剂(抗氧化剂)则能降低青蒿素的抗疟作用[1]。当疟原虫的过氧化物酶和过氧化氢酶受到抑制后，青蒿素的疗效则明显提高[2]。因此，自由基引发剂增加或自由基清除剂减少对青蒿素的抗疟活性都有增效作用。
为提高青蒿素的抗肿瘤效果，本研究以谷胱甘肽(gsh)耗竭剂马来酸二乙酯、谷胱甘肽过氧化物酶(gshpx)抑制剂巯基琥珀酸、过氧化氢酶(cat)抑制剂氨基三唑等自由基清除剂与青蒿琥酯组成抗肿瘤增敏复方，通过体外及体内实验比较复方与单方抑制人肝癌细胞株hepg2增殖及延缓荷瘤小鼠移植肿瘤生长的效果，并初步阐明青蒿琥酯增敏复方增强抗肿瘤效果的作用机制，为青蒿素抗肿瘤的临床应用打下基础。WwW.133229.coM现报道如下。
1材料与方法
11药物和试剂青蒿琥酯由桂林南药股份有限公司生产(批号：la090902)，马来酸二乙酯为东京化成工业公司产品，巯基琥珀酸为alfa公司产品，氨基三唑为上海精纯试剂有限公司产品，5氟尿嘧啶(5fu)、四甲基偶氮唑盐(mtt)、二甲基亚砜(dmso)均购自sigma公司，dmem培养基(低糖)购自gibco公司，胰酶、胎牛血清均购自tbd公司，蛋白质、gsh含量及gshpx、cat活性测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所生产(批号：20090221)。
12实验动物和肿瘤细胞株spf级balb/cnu裸鼠，雌性，4周龄，体质量16～18 g，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号：scxk粤20060015。人肝癌hepg2细胞株由中山大学提供。
13主要仪器ck40f200型倒置显微镜(olympus公司)，hw0301tvba型co2培养箱(harrls公司)，legend micro 17/17r 21/21r型高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技中国有限公司)，mk3型酶标仪(热电上海仪器有限公司)，bs124s型电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，722型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。
14mtt比色测定[3]取对数生长期的hepg2细胞，用25 g/l胰酶消化为单个细胞，作细胞计数，以培养液稀释为终浓度5×104/ml的单细胞悬液，每孔100 μl接种于96孔板中，置于37℃、体积分数5%co2培养箱中培养1～2 d，待细胞贴壁后，加入100 μl终浓度为10-7～10-2mol/l的药物于各孔中保温48 h后，每孔加入5 mg/ml mtt溶液20 μl，置于37℃、体积分数5%co2培养箱中保温4 h，小心吸掉孔中培养液，加入150 μl dmso，静置10 min后，用酶标仪测定490 nm处的光吸收值(d490)。
15gsh含量及gshpx、cat活性测定按试剂盒说明书操作。
16实验动物分组按照随机原则，将裸鼠分为5组：模型组，青蒿琥酯单方组(单方组)，青蒿琥酯+马来酸二乙酯+巯基琥珀酸+氨基三唑复方1、2组(复方1、2组)，阳性对照组(5fu组)，复方1、2组分别皮下(远离肿瘤部位)、瘤下(接近肿瘤部位)注射，每组各5只。
17癌细胞接种造模[4]用含体积分数10%胎牛血清的dmem培养基常规培养hepg2细胞，取对数生长期的培养细胞，以25 g/l胰酶消化，磷酸盐缓冲液(pbs)洗2次，1 000 r/min离心5 min，收集细胞，用生理盐水悬浮细胞，定容，取02 ml hepg2细胞(5×106～6×106/ml)接种于裸鼠颈背部皮下。
18给药方法接种10 d后成瘤体积约100 mm3时给药，青蒿琥酯剂量为40 mg·kg-1·d-1，马来酸二乙酯剂量为200 mg·kg-1·d-1，巯基琥珀酸剂量为20 mg·kg-1·d-1，氨基三唑剂量为74 mg·kg-1·d-1，5fu剂量为185 mg·kg-1·d-1[5]。皮下或瘤下注射量为10 μl，连续用药15 d。
19数据计算p生长抑制(%)=(1–d实验孔/d空白孔)×100%。p抑瘤(%)=(m瘤，模型组–m瘤，治疗组)/ m瘤， 模型组×100%。v肿瘤(mm3)=l肿瘤×h2肿瘤/2。
110统计学方法采用简明统计软件(cs2000)，版本号1034进行统计学处理。
2结果
21青蒿琥酯及其复方组成药物的细胞毒性测定将hepg2细胞经不同药物处理48 h后，采用mtt法测定各药物的d490值，由此计算得其半数抑制浓度(ic50)。结果显示：青蒿琥酯的ic50=70×10-5mol/l，马来酸二乙酯的ic50=20×10-5 mol/l ，巯基琥珀酸的ic50=21×10-4 mol/l ，氨基三唑的ic50=70×10-4 mol/l。由此可知，各药物对hepg2细胞的毒性由高到低依次为马来酸二乙酯>青蒿琥酯>巯基琥珀酸>氨基三唑。
22青蒿琥酯及其复方抗肿瘤细胞增殖的体外评价根据各药物对hepg2细胞的ic50进行青蒿琥酯复方配伍，其中青蒿琥酯浓度为5×10-5 mol/l ，马来酸二乙酯浓度为05×10-5 mol/l ，巯基琥珀酸浓度为1×10-5 mol/l ，氨基三唑浓度为1×10-4 mol/l。采用mtt法测定单方及复方作用后的d490值，由此计算得其p生长抑制，结果见图1。
图1结果表明，青蒿琥酯复方对hepg2细胞的生长抑制作用显著高于青蒿琥酯单方，2组生长抑制率比较差异有显著性意义(p<001)。
23自由基清除剂对青蒿琥酯抗肿瘤的增敏作用机理为了揭示青蒿琥酯复方的增敏机理，在hepg2细胞被药物分别作用24 h和48 h后，检测空白组、单方组和复方组中的gsh含量及gshpx、cat活性。
图2结果显示，经青蒿琥酯复方处理后，hepg2细胞中的gsh含量及gshpx、cat活性均较单方组有所降低，其中gshpx在药物作用24 h后的活性与空白组比较差异有显著性意义(p<005)，cat在药物作用24 h及48 h后的活性与空白组比较差异均有显著性意义(p<005)。
24青蒿琥酯及其复方抑制荷瘤裸鼠移植肿瘤生长的体内评价用药前先测定瘤体积，用药后剥取肿瘤，称量瘤体质量，测定瘤体积;根据用药后瘤体质量，计算单方组、复方组和5fu组的抑瘤率(%)，结果见表1。荷瘤裸鼠用药后的肿瘤形态见图3(彩图见第318页)。a. gsh含量b. cat活性c. gshpx活性表1青蒿琥酯及其复方对荷瘤裸鼠移植肿瘤生长的抑制作用
表1结果显示：用药后，复方1、2组及5fu组均可不同程度抑制肿瘤生长，其中复方2组与5fu组荷瘤体积显著降低，抑瘤率升高，与模型组比较差异有显著性意义(p<005或p<001)，表明瘤下注射复方抑瘤作用优于皮下注射。
由表1和图3可知，青蒿琥酯增敏复方的抑瘤作用高于青蒿琥酯单方，表明自由基清除剂在活体条件下仍有助于青蒿琥酯发挥其抗肿瘤作用。不过，按现有药物浓度，青蒿琥酯复方的抑瘤效果仍低于5fu，有待进一步从给药方式、剂量、配伍等方面加以改进。
3讨论
早在2000年，陈征途等[6]和吴玲霓等[7]就利用mtt染色、dna梯度电泳、流式细胞仪和透射电镜等多种分析手段证明，诱导细胞凋亡是青蒿琥酯体外抑制hepg2细胞增殖的机理之一。青蒿素类药物对铁离子化合物(如血红素)的高度亲和性赋予其更强的凋亡诱导活性。lai等[8]发现，双氢青蒿素对人淋巴细胞白血病细胞的杀伤作用比对正常人淋巴细胞的杀伤力大100倍，推测可能是癌细胞的含铁量高于正常细胞所致。郑青等[9]也发现，转铁蛋白对青蒿琥酯杀伤人肺癌细胞株a549具有增效作用，表明转铁蛋白富集的铁离子促进了青蒿琥酯羧自由基形成。
青蒿素类药物主要以羧自由基诱导细胞凋亡，因而易被gsh及其他非蛋白质巯基所破坏[10]。同时，青蒿素类药物可诱导肿瘤细胞中抗氧化酶基因表达，从而抵消青蒿素羧自由基对肿瘤的杀伤作用[11]。放射治疗增敏剂丁胱亚磺酰亚胺(bso)是最常用的gsh抑制剂，它通过抑制γ谷胱甘肽合成酶阻断gsh生成[12]。马来酸二乙酯(又名顺丁烯二酸二乙酯)和n乙基马来酰亚胺(又名n乙基顺丁烯二酰亚胺)也能在短期内使细胞内gsh耗竭。巯基琥珀酸(又名硫代苹果酸)和氨基三唑分别为gshpx和cat抑制剂，可降低细胞中的gshpx和cat活性。马来酸二乙酯只会使gsh在短时间内耗竭，停药后gsh含量即可回升，因此其毒性很低。巯基琥珀酸和氨基三唑只抑制抗氧化酶的活性，而不抑制其合成，因此其毒性也低。
本研究通过青蒿琥酯增敏复方的体外评价，初步证明复方中的3种促氧化剂(抗氧化酶抑制剂)能不同程度地降低gsh含量及gshpx、cat活性，而这些自由基引发效应与增敏复方对hepg2细胞较高的生长抑制率呈正相关。同时，体内实验结果也表明，增敏复方的抑瘤率较单方明显提高，表明这些增敏剂在活体肿瘤模型中也能很好地发挥增敏作用，初步验证了青蒿琥酯增敏复方优于青蒿琥酯单方的消瘤效果。虽然目前该复方的抗瘤作用还不及常规抗肿瘤药物，但若进一步优化使用剂量和给药方式，未来将有可能发展成为新一代临床肿瘤化疗复方药物。
【参考文献】
[1]senok a c，nelson e a s，li k，et al. thalassaemia trait，red blood cell age and oxidant stress: effects on plasmodium falciparum growth and sensitivity to artemisinin [j]. trans roy soc trop med hyg，1997，91: 585.
[2] meshnick s r，tsang t w，lin f b，et al. activated oxygen mediates the antimalarial activity of qinghaosu [j]. prog clin biol res，1989，313: 95.
[3] 司徒振强. 细胞培养 [m]. 西安: 世界图书出版公司，2001: 186.
[4] 曾纪晓，何晓顺，马毅. 雷帕霉素对人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用 [j]. 中华实验外科杂志，2007，24 (12): 1522.
[5] 徐淑云，卞如廉，陈修. 药理实验方法学 [m]. 北京: 人民卫生出版社，2003:1762.
[6] 陈征途，黄真炎，吴玲霓，等. 青蒿素介导肝癌细胞凋亡的实验研究 [j]. 中西医结合肝病杂志，2000，10 (5): 23.
[7] 吴玲霓，黄真炎，雷娓娓，等. 青蒿素诱导肝癌细胞凋亡的电镜观察 [j]. 新中医，2002，34 (3): 76.
[8] lai h，singh n p. selective cancer cell cytotoxicity from exposure to dihydroartemisinin and holotransferrin [j]. life sci，2001，70 (1): 49.
[9] 郑青，郭建红，周仲楼，等. 转铁蛋白对青蒿琥酯体外抗肿瘤活性的增效作用研究 [j]. 中草药，2008，39 (6):887.
[10] 徐亦益，陈绍芳. 青蒿琥酯的抗肿瘤作用 [j]. 中国肿瘤，2004，13 (10): 641.
[11] 叶启祥. 青蒿素类药物抗肿瘤研究进展 [j]. 实用医学杂志，2006，22 (5): 600.
[12]clark e p,epp e r,biaglow j e,et al.glutathion depletion，radiosensitization，and misonidazole potentiation in hypoxic chinese hamster ovary cells by buthionine sulfoximine [j]. radio res，1984，98: 370.
