作者：刁金囡，盛梅笑，何伟明，朱长乐，王宁皎
【摘要】 【目的】观察黄芪注射液对腹膜透析大鼠腹膜间皮细胞水孔蛋白1(aqp1)表达的影响。【方法】选用雄性sd大鼠25只，分正常对照组(n=7)、模型组(n=9)和黄芪组(n=9)。除正常对照组外，其他两组分别腹腔注射含425 g/l葡萄糖的腹透液和含425 g/l葡萄糖的腹透液+黄芪注射液(20 mg/ml)，剂量为25 ml/d，连续10 d。于第11天观察大鼠透析超滤量(uf)与净超滤量(net uf)、腹膜钠转运(d/p na)、腹膜组织光镜病理形态及aqp1免疫组化的表达。【结果】 透析液留腹60 min时黄芪组uf、net uf与模型组比较显著增加(p<005)。透析液留腹30 min、60 min时黄芪组d/p na较模型组显著减低(p<005)。黄芪组大鼠腹膜层增厚、间皮细胞脱落情况较模型组减轻，aqp1在腹膜间皮细胞的表达较模型组增多(p<005)。【结论】黄芪注射液可减轻高浓度葡萄糖腹透液对间皮细胞的损伤，提高aqp-l在腹膜间皮细胞的表达，改善透析液留腹早期跨细胞水转运功能，从而提高腹膜对水的清除，增加透析超滤量。
【关键词】 黄芪注射液/药理学;腹膜度析;腹膜/病理学;疾病模型，动物;大鼠
长期应用高浓度葡萄糖透析液可造成腹膜间皮细胞受损，使腹膜对水的清除能力减低。WWw.133229.cOm近年的研究发现，腹膜组织水孔蛋白1(aqp1)在腹膜跨细胞水转运中起着重要作用，它介导了腹膜总水清除量的50%[1]。aqp1主要分布于腹膜的毛细血管及小静脉的内皮细胞上，在腹膜间皮细胞也有表达[2]。本实验观察了黄芪注射液对腹膜透析大鼠腹膜间皮细胞aqp1表达、腹膜组织病理形态、透析超滤量、腹膜钠转运(d/p na)的影响，现报道如下。
1材料与方法
11实验动物及分组普通清洁级雄性sd大鼠25只，体质量(200±20)g ，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：scxk(浙)2003-001。所有实验动物均经适应性喂养1周。分为正常对照组、模型组和黄芪组。
12药物及试剂腹膜透析液(含葡萄糖425 g/l)由广州百特医疗公司生产(批号g0708045)，黄芪注射液(每10 ml相当于生药20 g)由成都地奥制药有限公司生产(批号070351)，水合氯醛(100 mg/l)由江苏省中医院制剂部生产(批号070821)，aqp1(h55)一抗由santa cruz biotechnology公司生产(批号sc20810)，即用型快速免疫组化maxvisiontm二抗试剂盒、3，3二氨基联苯胺(dab)显色剂均由福州迈新生物公司生产(批号kit5030)。
13黄芪腹透液的配制将黄芪注射液20 ml加入2 l腹透液中，配制成浓度为20 mg/ml的黄芪腹透液，临用即配。
14实验步骤正常对照组按常规饲养，模型组与黄芪组自实验第1天，采用50 ml一次性无菌注射器，在常规消毒下以5号针头从大鼠右下腹直接腹腔注入腹透液25 ml/d，模型组为含425 g/l葡萄糖的腹透液，黄芪组为含425 g/l葡萄糖的腹透液+黄芪注射液(20 mg/ml)，连续10 d。第11天各组大鼠称体质量后给予水合氯醛(35 ml/kg)肌注麻醉，从剑突下2 cm旁开07 cm向下腹插入18g一次性外科笔筒式静脉留置针，经留置针管腹腔注入含425g/l葡萄糖的腹透液25 ml，留腹120 min。分别于注入腹透液30、60 min后由静脉留置针采集腹透液05 ml，以备测透析液na+浓度。于60 min从大鼠眼眶后静脉丛采血2 ml，送检血清na+浓度。120 min留取腹透液标本后，经留置针管排放出腹腔内液体，处死大鼠并沿腹中线剪开腹部，用灭菌干纱布吸干腹腔内剩余液体，称体质量，计算出液量。并取大鼠膈腹膜，体积分数10%福尔马林液固定，送检光镜苏木素—伊红(he)染色及aqp1免疫组化。
15观察指标
2010年第27卷广州中医药大学学报151超滤量(uf)与净超滤量(net uf)net uf( ml)= uf( ml)-0 min时注入腹腔中的透析液量(25 ml)，uf( ml)= 120 min时腹腔内液体容量 [包括该时点通过留置针排放的液量( ml)+ 采集标本的总液量(1 ml) + 纱布净质量(g)]。纱布净质量(g)= 纱布湿质量(g)-纱布干质量(g)，1 g纱布质量相当于1 ml透析液。
152腹膜钠转运(d/p na)d/p na = 某时间点透析液na+浓度/60 min时血清na+浓度。
153腹膜光镜病理取大鼠膈腹膜光镜标本，逐级酒精脱水，石蜡包埋，连续切片，厚度3 μm，he染色，中性树胶封片。光镜下观察腹膜层厚度、间皮细胞形态及脱落情况、间皮下基质的变化等。
154腹膜aqp1免疫组化检测步骤如下：石蜡切片脱蜡水化，微波中档抗原修复10 min，自然冷却，磷酸盐缓冲液(pbs，001 mol/l，ph 74)冲洗2 min×3次。正常山羊血清封闭，室温孵育10 min，倾去血清，勿洗，滴加1∶100稀释的aqp1一抗，37℃孵育1 h，pbs冲洗2 min×3次。滴加即用型快速免疫组化maxvisiontm二抗，37℃孵育10~15 min，pbs冲洗2 min×3次。滴加新鲜配制的dab显色剂3~5 min，显微镜下观察。自来水充分冲洗，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
aqp1在腹膜间皮细胞表达的积分评估：参照watanabe免疫组化半定量评分标准[3]。高倍镜下连续观察5个视野(200倍)，视野里棕黄色颗粒为阳性着色，按细胞比率和染色的强度分为5个级别：阳性细胞<5%，未被染色为阴性(-)，计为0分。阳性细胞5%~15%，呈浅棕色为弱阳性(±)，计为1分。阳性细胞15%~30%，棕色为阳性(+) ，计为2分。阳性细胞30%~50%，深棕色为阳性(2+)，计为3分。阳性细胞>50%，棕褐色为强阳性(3+)，计为4分。
2结果
21各组大鼠uf、net uf的比较表1结果显示，透析液留腹120 min时，模型组uf、netuf显著低于正常对照组(p<005)，黄芪组uf、net uf显著高于模型组(p<005)，黄芪组与正常对照组uf、net uf比较差异无显著性意义(p>005)，提示高浓度葡萄糖透析液可使腹膜的超滤功能下降，腹透液中加入黄芪注射液可以提高腹膜对水的清除，增加透析超滤量。表1各组大鼠uf、net uf的比较
22各组大鼠d/p na的比较表2结果显示，透析液留腹60 min时各组大鼠d/p na均较30 min减低，同时点组间比较，模型组d/p na均显著高于正常对照组(p<005)，黄芪组d/p na较模型组显著降低(p<005)，表明使用高浓度葡萄糖透析液后腹膜的跨细胞水转运能力下降，而黄芪能够改善这种水转运功能的受损，提高水从血浆转运进入透析液的速率。表2各组大鼠d/p na的比较②统计方法：单因素方差分析;①p<005,与正常对照组比较;②p<005,与模型组比较
23各组大鼠腹膜光镜病理检查结果光镜下正常对照组腹膜组织腹膜层较薄，间皮细胞完整，呈扁平状，纤维结缔组织较致密。模型组腹膜层较正常对照组明显增厚，间皮细胞脱落明显，局部间皮细胞增生、肥大，间皮下结缔组织松散。黄芪组腹膜层轻度增厚，间皮细胞散见脱落、增生，纤维结缔组织较致密。结果见图1。
24各组大鼠腹膜间皮细胞aqp1的表达aqp1在腹膜组织间皮细胞及毛细血管壁内皮细胞染色阳性(棕黄色)。模型组积分显著低于正常对照组(p<005)，黄芪组积分显著升高，与模型组比较差异具有显著性意义(p<005)。表明黄芪组较模型组aqp1在腹膜间皮细胞的表达量增多。结果见表3、图2。表3各组大鼠腹膜间皮细胞 aqp1的表达
3讨论
水通道蛋白是存在于细胞膜上的一种与水的通透性有关的转运蛋白，又称水孔蛋白(aquaporin，aqp)。迄今为止，在哺乳动物共发现有11种水通道蛋白，它们介导着不同类型细胞膜的跨膜水转运。腹膜上的水通道蛋白主要是aqp1，它是腹膜超小孔的分子结构，与腹膜跨细胞水转运密切相关。腹膜透析(peritoneal dialysis，pd)对水分的超滤受多种因素的影响，其中腹膜的跨细胞水转运起着关键作用，跨细胞水转运功能受损是导致超滤失败(ultrafilltration failure，uff)的重要原因之一。研究表明透析液留腹早期的纯水转运与aqp1在腹膜的表达密切相关，aqp1减少或功能丧失均可能导致uff[4]。但也有研究认为在uff的发生中，aqp1结构的改变可能比表达量的改变更为重要[2]。有人发现aqp1结构与功能的改变与高糖等非生物相容性因子的长期刺激使aqp1的功能片断如chip28等蛋白质发生了非酶糖基化有关[5]。此外，aqp1可能存在“穿梭”调节机制[6]，aqp1在细胞内分布的变化也可能影响其跨细胞水转运。
刁金囡，等.黄芪注射液对腹膜透析大鼠腹膜间皮细胞水孔蛋白1(aqp1)表达的影响腹膜间皮细胞在pd治疗中的作用一直受到关注。间皮细胞除了能维持腹膜结构的完整性外，还具有强大的分泌功能，如分泌血管内皮生长因子(vegf)、前列腺素e2(pge2)及转化生长因子-β(tgf-β)等，这些因子在腹腔局部的炎症防御、腹膜溶质和水的转运、腹膜纤维化的形成等方面起着重要作用。本实验结果显示高浓度葡萄糖透析液可使腹膜的超滤功能下降，腹透液中加入黄芪注射液可以提高腹膜对水的清除，增加透析超滤量。腹膜aqp1的免疫组化结果显示模型组 aqp1在腹膜间皮细胞的表达下降，尤其是在腹膜增厚的部位，而黄芪组光镜下腹膜层增厚、间皮细胞脱落的程度均较模型组有所减轻，同时腹膜间皮细胞所表达的 aqp1显著增多，提示黄芪对腹膜间皮细胞具有保护作用，它能够减轻高糖腹透液对间皮细胞的损伤，提高aqp1在腹膜间皮细胞的表达。
另一方面，在应用高浓度葡萄糖透析液进行pd的过程中，可观察到腹透液钠浓度与血钠浓度比值(d/p na)明显下降的现象，它表明水从血浆转运进入透析液的速率要大于钠离子的转运速率，即存在着腹膜对钠和水转运分离的现象，如同钠离子被“筛”了出去，称为“钠筛”现象。“钠筛”现象在高渗腹透液留腹30~60 min时最为明显，它的存在提示了腹膜上有超小孔允许水的自由转运。因此，可以通过测定1 h d/p na来评估腹膜水通道介导的水转运功能[6] ，d/p na高说明“钠筛”现象消失水转运功能下降。在本实验中，我们观察了大鼠30 min及60 min时 d/p na的变化，结果表明高渗腹透液在腹腔中停留的1 h内，各组大鼠透析液留腹60 min的d/p na均较30 min减低，在同一时点模型组d/p na高于正常组，黄芪组d/p na高于正常组但显著低于模型组(p<005)，说明使用高浓度葡萄糖透析液后由腹膜水通道介导的水转运能力下降，而黄芪能够改善透析液留腹早期的这种跨细胞水转运功能受损状况，提高水从血浆转运进入透析液的速率，其机制很可能是通过调节aqp1在腹膜组织的表达来实现的。
综上所述，本实验进一步证实了腹膜间皮细胞上存在着 aqp1的表达，黄芪注射液可减轻高糖腹透液对间皮细胞的损伤，提高aqp1在腹膜间皮细胞的表达，改善透析液留腹早期跨细胞水转运功能，从而提高腹膜对水的清除，增加透析超滤量。至于其调节 aqp1表达的确切机制还需做进一步的深入研究。
【参考文献】
[1] flessner mf the transport barrier in intraperitoneal therapy[j] am j physiol renal physiol，2005，288(3)：f433
[2] 方炜，钱家麒，余志远，等 水孔蛋白 1在人腹膜组织的表达及腹膜透析对其表达的影响[j]中华肾脏病杂志，2003，19(1)：29
[3] watanabe h, kanzaki h, narukawa s, et al bcl2 and fas expression in eutopic and ectopic human endometrium during the menstrual cycle in relation to endometrial cell apoptosis[j] am j obstet gynecol, 1997,176：360
[4] schoenicke g，diamant r，donner a，et a1 histochemical distribution and expression of aquaporin 1 in the peritoneum of patients undergoing peritoneal dialysis： relation to peritoneal transport[j] am j kidney dis，2004，44(1)：146
[5] monquil m c，imholz a l，struijk d g does impaired transcelluar water transport contribute to net ultrafiltration failure during capd[j]?perit dial int，1995，15(1)：42
[6] akiba t，ota t，fushimi k，et al water channel aqp1 in the primary cell culture of rat peritoneum[j] adv perit dia1，1999，15：3
