作者：林励,欧剑锋,廖观荣,邱金裕,蔡岳文,肖凤霞,李向明
【摘要】 【目的】探讨道地化橘红药材——毛橘红形成原因。【方法】采用高效液相、随机扩增多态性dna分析、等离子发射光谱法分别分析不同产地化橘红的柚皮苷含量、遗传距离以及土壤中al、k、ca、fe、ti、b、mg、mn 8种元素丰度,并应用spss 115统计软件作相关性分析。【结果】产地土壤表土层ca丰度对柚皮苷含量有显著影响,心土层al、k元素丰度差值与化橘红遗传距离呈显著相关。【结论】毛橘红形成的原因可能与当地盛产的礞石有一定关系。
【关键词】 化橘红 柚皮苷/分析 道地性 色谱法,高压液相
abstract: objectiveto explore the genuineness of exocarpium citri grandis (ecg) from huazhou city of guangdong province.methodswe used the method of high performance liquid chromatography to detect the naringin content in ecg from different producing areas of huazhou city. random amplified polymorphic dna analysis was used for the examination of genetic distance, and plasmaatomic emission spectrometry for the detection of soil elemental abundance of 8 elements such as aluminium (al), kalium (k)，calcium (ca)，ferrum(fe),titanium(ti),boron(b),magnesium(mg),and manganese(ma). the correlation of the above three parameters was analyzed by statistical software spss 115. resultsca abundance in the surface soil layer had an obvious effect on the content of naringin, and the difference of al and k abundance in subsoil layer was correlated with the genetic distance of ecg. conclusionthe genuineness of ecg is probably related with the abundance of phlopopitum in the soil of producing areas of huazhou city．
key words:exocarpium citrl grandis;naringin/analysis;genuineness;chromatography, high pressure liquid
化州柚citrus grandis‘tomentosa’为柚citrus grandis的栽培变种,其外果皮为中药化橘红,由于密被绒毛,称之为毛橘红［1］,为治疗痰证常用中药。WWw.133229.CoM明代《本草原始》云：“橘红,广东化州者胜”。外果皮密被绒毛的柚——化州柚仅产于广东省化州市,种植历史已有千年［2］,为著名道地药材。为了探明其形成原因,作者进行了初步研究。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 仪器p680a型高效液相色谱仪(德国dionex),联用自动进样器及二极管阵列检测器，bs110型万分之一电子分析天平(德国sartorius)，dyy6c型电泳仪(北京市六一仪器厂)，15csr型冷冻高速离心机(美国beckman)，2400型聚合酶链反应(pcr)仪(美国pe)，qr型纯水仪(法国millipore)，gds7600型凝胶成像仪(英国uvp)，spectra fluor plus多功能酶标仪(瑞士tecan)，spectro cirosccd等离子发射光谱仪(德国)。
1.2 试剂甲醇(色谱纯)，水(原子水)，石油醚(60℃～90℃)、醋酸、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等试剂均为分析纯，浓硝酸、氰氟酸、高氯酸试剂均为优级纯，柚皮苷对照品(自制,纯度9812%)，野漆树苷对照品(自制,纯度9857%)，goidvoew染料(北京赛百盛生物工程有限公司)，agarose琼脂糖( regular,西班牙biowest)，sk2492型pcr扩增试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，100个随机引物s1～s100(10个碱基,上海生工生物工程有限公司)，博彩3s柱离心式植物基因组dna试剂盒(上海申能)。
1.3 样品毛橘红、光橘红（柚果皮）等样品均来自广东化州市、广州市(移栽品)及广西陆川市(见表1),并经广东省中药研究所丘金裕主任中药师鉴定。表1 样品来源、原植物形态及采样点环境（略）
1.4 随机扩增多态性dna分析化橘红样品的随机扩增多态性dna分析按照文献［3］方法进行。
1.5 柚皮苷含量及总黄酮指纹图谱分析化橘红样品的柚皮苷含量测定及总黄酮指纹图谱制备均按照文献［4］方法进行。
1.6 土壤元素丰度分析
1.6.1 土壤采样在化橘红原植物植株外围进行土壤采集,注意避开施肥圈对土样带来的影响。挖地深50 cm,用竹勺刮去表层土壤,以去除铁锄的铁元素的影响。分段刮取土样,表土层0～25 cm,心土层25～50 cm,各约1 kg。
1.6.2 土样处理定量称取土样样品于聚四氟乙烯塑料瓶中,加10 ml浓硝酸、10 ml氰氟酸和2 ml高氯酸,加热溶解样品,冷却后定容,待测。
1.6.3 土样测定调整等离子发射光谱仪狭缝刻度读数(观测高度15 mm,高频发生器输出功率为132 kw,反射功率< 5 w,溶液提升量26 ml/min)；氩气流量：冷却气120 l/min、等离子气10 l/min、载气 10 l/min；积分时间为12 s；室温为20 ℃；湿度为65%。分别测定fe、ti、al、b、k、mn、mg、ca 8种元素,分别以220350 nm或228802 nm为测定波长。
1.7 土样元素丰度与化橘红质量及遗传距离关系采用spss 115统计软件,对样品柚皮苷含量或遗传距离与相对应产地中丰度较高的fe、ti、al、b、k、mn、mg、ca元素分别进行相关性分析,求得相关系数和p值。
2 结果
2.1 随机扩增多态性dna分析结果
依法进行随机扩增多态性dna分析研究,得不同引物扩增图谱,图1和表2为引物s84扩增图谱及遗传距离指数。表2结果显示,柚与化州柚之间的遗传距离并不大于不同产地化州柚之间的遗传距离,产地间的生态因子的差异可显著影响化州柚的遗传距离。表2不同产地化橘红遗传距离指数比较（略）
2.2 柚皮苷含量及总黄酮指纹图谱分析结果
依法进行样品柚皮苷含量及总黄酮指纹图谱分析,柚皮苷含量结果见表3,总黄酮指纹图谱以图2(化州柚)和图3(柚)为代表。结果显示,野漆树苷峰值化州柚显著高于柚,形成了差异显著的特征指纹图谱。表3化橘红样品中柚皮苷含量（略）
2.3 土样元素丰度分析结果
依法对土壤样品相对应产地中丰度较高的fe、ti、al、b、k、mn、mg、ca元素进行丰度分析。结果见表4,各产地土壤表土层与心土层所测元素丰度大都相近,但不同产地土样所测元素丰度可能存在差异。表4各产地土样主要元素丰度测定结果（略）
2.4 各土样中无机元素丰度与柚皮苷含量、遗传距离关系分析
依法分别对各样品的柚皮苷含量或遗传距离与其相对主要元素丰度进行相关性分析,结果见表5、表6。表5柚皮苷含量与产地土样元素丰度的相关性，表6遗传距离与产地土样元素丰度差值的相关性（略）
表5结果显示：土样中无机元素丰度与样品中柚皮苷含量多呈负相关,但仅表土层土样钙元素丰度与柚皮苷含量间所呈现的负相关具有统计学意义(p<005)。
表6结果显示：心土层土样铝元素和钾元素的丰度差值均与遗传距离呈正相关,具有统计学意义(p<005或p<001)。
3 讨论
化州柚是柚的栽培变种,属于一种外果皮上有绒毛的柚,仅生长在广东省化州市,与柚相比,化州柚在外观形状、显微特征、化学成分等方面已出现显著差异［3］,本研究结果也显示两者总黄酮指纹图谱存在显著差异,但其遗传距离并不显著大于不同产地化州柚之间的差异,可见产地间生态因素的差异可显著影响化州柚的遗传距离,提示该柚的栽培变种遗传基因具有不稳定的特性。
因此,本研究选点范围集中在化州柚产地或周边10 km内的相邻村镇,其气候因子、地形因子、生物因子等大都相近。对土壤因子的初步研究结果显示：土样中无机元素丰度与样品中柚皮苷含量多呈负相关,但只有表土层土样钙元素丰度与柚皮苷呈显著负相关(p<005)。提示生产中如大量施用石灰等含ca元素丰富的肥料或农药,有可能会显著影响化州柚果皮中柚皮苷含量。
研究结果还显示：心土层土样铝元素丰度差值与遗传距离呈极显著正相关(p<001)。心土层钾元素丰度差值与遗传距离呈显著正相关(p<005)。而其他元素丰度差值与遗传距离均无显著相关性(p>005)。初步表明土壤中铝元素及钾元素对化州柚基因有显著影响。
化州柚产地多盛产中药礞石,礞石为硅酸盐类矿石,善治顽痰胶结阻肺之气逆喘咳、痰积惊痫等证。礞石主要组成元素包括铝和钾元素,而本研究结果初步显示,土壤心土层铝、钾元素对化州柚遗传距离有显著影响,提示化橘红(毛橘红)的道地性可能与当地盛产的礞石有一定关系,值得进一步深入研究。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［m］.北京:化学工业出版社,2005：51.
［2］ 梁文皓.化州橘红志［m］.广州：广东科学技术出版社,1993：1.
［3］ 林励,陈志霞,袁旭江,等.两种化橘红的质量鉴别［j］.广州中医药大学学报,2004,21 (4):308.
［4］ 林励,黄兰珍,欧剑锋,等.化橘红原植物化州柚生长过程中黄酮类成分的变化规律研究［j］.广州中医药大学学报, 2006,23 (3):256.
