作者：郭金鹏，庞佶，王新为，谌志强，金敏，李君文
【摘要】 目的研究鸡血藤提取物不同组分的抗柯萨奇b3病毒活性和性质。方法通过不同溶剂提取鸡血藤活性成分，细胞病变效应法和四甲基偶氮唑盐比色法(mtt)测定不同提取组分的体外抗柯萨奇b3病毒活性。结果通过初步分离纯化得到有效成分具有抗柯萨奇b3病毒活性。用mtt法研究了鸡血藤水提物和有效成分的细胞毒性和抗柯萨奇b3病毒活性，cc50分别为725.88，179.17 μg/ml，ic50分别为87.17，9.14 μg/ ml，ti 分别为8.32，19.60。阳性对照为利巴韦林(ribavirin)的cc50为4 900 μg/ml，ic50为156.2 μg/ml，其ti为31.4。结论鸡血藤有效成分在体外能明显抑制柯萨奇b3病毒的致细胞病变作用。
【关键词】 鸡血藤; 柯萨奇b3病毒; 四甲基偶氮唑盐比色法; 细胞病变效应法
abstract：objectiveto assay the anti-coxsackie virus b3 effects of the different extracts from spatholobus suberectus dunn. methods the anti-coxsackie virus b3 activity of the extracts of spatholobus suberectus dunn. was proved by cytopathogenic effect (cpe) method and mtt method. resultsby re-extracting with different solvents, the partially separated components from spatholobus suberectus dunn. maintaining antiviral activity were obtained. the 50 % cytotoxity concentration (cc50), 50 % inhibition concentration (ic50) and therapy index (ti) of the crude water extract and the partially separated components were 725.88 μg/ml, 87.17 μg/ml, 8.32 and 179.17 μg/ml, 9.14 μg/ml, 19.60, respectively ,measured by mtt method with ribavirin as the positive control.conclusionthe assays show that the partially separated components have remarkable anti-coxsackie virus b3 activity in vitro.
key words： spatholobus suberectus dunn.; coxsackie virus b3; mtt method; cpe method
柯萨奇病毒b3 (coxsackievirus group b type 3，cvb3) 是病毒性心肌炎的主要病原[1,2]，病毒持续感染可导致扩张型心肌病[3,4]。WWW.133229.coM目前，临床缺乏有效的抗病毒 治疗 药物。鸡血藤是一味沿用千年的活血化淤中药,古代多篇本草论著中都记载了其“去淤血，生新血”的功效，并称之为“血分之圣药”[5]。中医认为其有补血活血、舒筋活络的功能，用于治疗月经不调、血虚萎黄、麻木瘫痪、风湿痹痛等症[6]。 现代 临床常用鸡血藤(单用或以鸡血藤为主组方)治疗各种原因(如放化疗、血液系统疾病) 引起的白细胞、血小板、红细胞等全血象减少疾病[7]。近年来对鸡血藤化学成分和药 理学 研究证明，在抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等方面具有较好的作用。实验证明，密花豆(鸡血藤原材的一种)提取物对单纯疱疹病毒ⅰ型有较强的作用，且细胞毒性低，其50%细胞致死浓度 (cc50) 为阿糖胞苷的3倍，选择毒性指数(st)与阿糖胞苷相同。密花豆总提取物和其聚酰胺柱层析成分在抗hiv 逆转录酶(hiv-rt)活性抑制实验中显示出较强的作用，当浓度为0.4 μg/ ml 其抑制率为83.12%～94.01%，当浓度为1 μg/ ml 其抑制率为97.5%～99.86%，当浓度为2 μg/ ml 可完全抑制hiv-rt的活性[8]。厚果鸡血藤水提物和乙醇提取物除具有抑制hiv-rt的活性外，并且可抑制dna 多聚酶和rna 多聚酶[9]。鸡血藤抗病毒作用的研究目前仅局限于疱疹病毒和艾滋病毒等。本研究将鸡血藤水提液针对肠道病毒属柯萨奇b3病毒进行了体外抗病毒实验，并对有效成分进行了初步提取和分离，以期为在抗病毒方面的广泛应用提供数据。
1 材料与仪器
1.1 材料鸡血藤spatholobus suberectus dunn.购自天津达仁堂药店。细胞，非洲绿猴肾细胞(vero e6 cell line)，本室保存。病毒，coxsackie virus b3 (cvb3)，柯萨奇病毒b3，本室保存。
1.2 试剂培养基，rpmi - 1640 ( gibco 产品) 按照说明溶解，调节至ph7.2，g5砂芯漏斗过滤除菌，加入胎牛血清(天津川页有限公司)至浓度为10%，100 u/ml青霉素(重庆药友制药有限责任公司) 和100 μg/ml硫酸链霉素(上海四药股份有限公司)，胰蛋白酶( gibco产品)，噻唑蓝(mtt，sigma 产品)，50 ml 培养瓶、96孔培养板(costar产品)，利巴韦林注射液(ribavirin injection，上海通用药业股份有限公司，批号040661);磷酸缓冲液pbs(不含ca2+ ，mg2+ )：自配，所用化学试剂为国产分析纯，d-101大孔树脂为天津海光化工厂产品。
1.3 仪器砂芯漏斗，g5 吉林省长春市玻璃制品厂。酶标仪，芬兰labsystem公司。真空冷冻干燥机，labconco产品。
2 方法
2.1 vero e6 细胞培养将培养瓶中长成单层的vero e6细胞用pbs轻轻地洗3次，然后加入0.25%胰蛋白酶溶液5～6 ml消化成单细胞，用新鲜培养基稀释成1×105 cell/ ml的细胞悬液，接种至96孔细胞培养板，每孔0.2 ml，37℃，5 % co2 培养24 h，待vero e6 细胞长成单层后进行研究。
2.2 样品对vero e6细胞毒性研究对不易溶于水的样品，用二甲亚砜(dmso) 溶解后用培养基稀释成4 000 μg/ ml，控制dmso的浓度不大于1%;对于易溶于水的样品直接用培养基配成4 000 μg/ ml 的溶液;最后用微孔滤膜过滤除细菌，倍比稀释成8个浓度，最低浓度为32 μg/ ml。
2.2.1 cpe法待96孔板细胞长成单层后倾去培养基，加入样品溶液，每个样品浓度3个复孔，每孔0.2 ml，细胞对照孔加入新鲜培养基，37℃，5%co2培养72 h，在倒置显微镜下每日观察记录结果。
2.2.2 四甲基偶氮唑盐比色法(mtt法)72 h后，每孔加入5 mg/ml mtt溶液15 μl，37℃，5% co2继续培养4 h,可见蓝黑色甲臜颗粒，吸去上清，加入0.1 ml二甲亚砜，在振荡器上振荡5 min，使甲臜颗粒充分溶解，用酶标仪进行双波长(492及630 nm)法测定吸光度值，按照reed & muench法[10，11] 计算 药物对细胞的半数毒性浓度(cc50)。
2.3 样品抗柯萨奇b3病毒活性研究待96孔板细胞长成单层后倾去培养基，取冻存病毒液，用pbs稀释1 000倍后，每孔加入稀释的病毒液20 μl，37℃，5% co2吸附1 h，吸去病毒液，加入样品溶液，每个浓度3个复孔，每孔0.2 ml，同时设阴性对照(加入新鲜培养基0.2 ml)、阳性药物对照(加入0.2 ml倍比稀释的ribavirin ) 和细胞对照(不加病毒液，加入0.2 ml新鲜培养基)，37℃，5 %co2培养72 h，镜检记录，mtt法测定od值。
按照reed & muench法计算药物对病毒的半数抑制浓度(ic50)和治疗指数(ti)。
抑制率( %) = (1-给药实验组平均od值/细胞空白对照组平均od 值)×100 %
ic50 = antilog {b +[50 - ( < 50 %累积抑制率)/( > 50 %累积抑制率) - ( < 50 %累积抑制率) ×c]}
b = log ( < 50 %样品浓度) , c = log (稀释倍数)
ti =半数毒性浓度(cc50)/半数抑制浓度( ic50)
2.4 鸡血藤水提物的分离纯化将新鲜鸡血藤干粉，用5倍体积的蒸馏水室温浸提24 h，过滤得到滤液，55℃减压蒸馏浓缩得到鸡血藤水提物，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取浓缩水溶液，得到石油醚相、醋酸乙酯相、正丁醇相、水相等4个组分，水相冻干，其他3个组分55℃减压蒸馏浓缩蒸干，进行抗cvb3 活性研究。
水相过101大孔吸附树脂，依次用3倍体积的水、25 %乙醇、50 %乙醇、75 %乙醇和100 %乙醇洗脱，5个组分冻干后进行抗cvb3活性研究。合并乙醇洗脱组分，在55℃减压蒸馏浓缩除去乙醇，冻干得到具有抗cvb3活性的有效组分。
2.5 鸡血藤水提物和有效组分的抗柯萨奇b3病毒活性研究把鸡血藤水提物和有效组分用培养基配成4 000、1 000 μg/ml，微孔滤膜过滤，倍比稀释成8个浓度，进行细胞毒性研究，用mtt 法测定细胞率，计算cc50;以最高无细胞毒浓度为起始浓度，往下倍比稀释成若干个浓度，进行抗cvb3活性研究，以1 000 μg/ ml的ribavirin为阳性对照，用mtt法测定细胞病变抑制率，计算ic50和ti。
2.6 有效组分的理化性质研究将有效组分用蒸馏水溶解，进行α-2-萘酚-硫酸反应，溶液分别用1% fecl3乙醇溶液、醋酐-浓硫酸反应、碘化钾、双缩脲等显色剂显色，鉴定有效组分中各成分的化学性质[12]。
3 结果
3.1 鸡血藤水提物分离纯化与抗柯萨奇b3病毒活性研究
3.1.1 石油醚相、醋酸乙酯相、正丁醇相、水相等4个组分抗cvb3活性水相组分直接用新鲜的培养基配成4 000 μg/ ml，过滤除菌;石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相用少量二甲亚砜(dmso)溶解后，用培养基稀释至4 000 μg/ml，过滤除菌;最后每个样品都倍比稀释至32 μg/ ml，共8个浓度。细胞毒性镜检结果见表1。表1 4个组分的细胞毒性
“-”表示细胞正常;“+”表示细胞在样品或者病毒的作用下有约25%发生了病变;“++”表示细胞在样品或者病毒的作用下有约50%发生了病变;“+++”表示细胞在样品或者 病毒的作用下有约75%发生了病变;“++++”表示细胞在样品或者病毒的作用下100%发生了病变
实验结果表明，石油醚相、醋酸乙酯相、正丁醇相、水相等4个组分对vero细胞无毒的最高浓度依次为1 000，1 000、1 000、500μg/ml。以最高无细胞毒性浓度为起始浓度，倍比稀释6个浓度，进行抗cvb3活性研究。镜检结果见表2。表2 4个组分抗coxsackie virus b3病毒活性结果
“-”表示细胞正常;“+”表示细胞在样品或者病毒的作用下有约25%发生了病变;“++”表示细胞在样品或者病毒的作用下有约50%发生了病变;“+++”表示细胞在样品或者 病毒的作用下有约75%发生了病变;“++++”表示细胞在样品或者病毒的作用下100%发生了病变
实验结果表明：石油醚相、醋酸乙酯相、正丁醇相等3个组分都没有抗病毒活性;水相组分在浓度为125 μg/ml时能够完全抑制病毒对细胞的致病变作用，63 μg/ml时可以部分抑制病毒对细胞的致病变作用，稀释32倍的样品浓度对病毒的致细胞病变作用没有什么效果，与空白对照一样。
3.1.2 d-101大孔吸附树脂洗脱组分的抗cvb3活性水相经过101大孔吸附树脂，依次用2倍体积的水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、100%乙醇洗脱，将5个组分冻干，用新鲜培养基配成4 000 μg/ml，然后过滤除菌，倍比稀释成8个浓度，进行细胞毒性研究。镜检结果见表3。表3 乙醇洗脱组分对vero e6细胞的毒性
“-”表示细胞正常;“+”表示细胞在样品或者病毒的作用下有约25%发生了病变;“++”表示细胞在样品或者病毒的作用下有约50%发生了病变;“+++”表示细胞在样品或者 病毒的作用下有约75%发生了病变;“++++”表示细胞在样品或者病毒的作用下100%发生了病变
结果表明，水洗脱组分、25%乙醇洗脱组分、50%乙醇洗脱组分、75%乙醇洗脱组分、100%乙醇洗脱组分的最高无细胞毒性浓度分别为250，250，125，125，125 μg/ml。
以最高无细胞毒性浓度为初始浓度，倍比稀释8个浓度，进行抗cvb3活性研究，镜检结果如表4。表4 乙醇洗脱组分抗coxsackie virus b3病毒活性结果
“-”表示细胞正常;“+”表示细胞在样品或者病毒的作用下有约25%发生了病变;“++”表示细胞在样品或者病毒的作用下有约50%发生了病变;“+++”表示细胞在样品或者 病毒的作用下有约75%发生了病变;“++++”表示细胞在样品或者病毒的作用下100%发生了病变
从表4可以看出，水洗脱组分没有抗cvb3活性，25%乙醇洗脱组分在63 μg/ml时可以完全抑制cvb3的致细胞病变作用，50%乙醇洗脱组分和75%乙醇洗脱组分在16 μg/ml时可以完全抑制cvb3的致细胞病变作用，100%乙醇洗脱组分在63μg/ml时可以完全抑制cvb3的致细胞病变作用，合并乙醇洗脱组分，冻干得到具有抗cvb3活性的有效组分。
3.2 鸡血藤水提物和有效组分抗cvb3活性
3.2.1 鸡血藤水提物和有效组分对vero e6 细胞的毒性对水提物和有效组分进行vero e6 细胞毒性研究，mtt 法测定结果。结果如图1。从图1中可看出，水提物浓度在500 μg/ml时，细胞率已经达到了76.4%，有效组分浓度在125 μg/ml时，细胞成活率已经达到了74.6%，对细胞基本没有毒性。水提物和有效组分的cc50分别为725.88，179.17 μg/ml。
3.2.2 鸡血藤水提物和有效组分的抗cvb3活性鸡血藤水提物和有效组分分别以500，125 μg/ml为起始浓度，倍比稀释6个浓度,进行抗cvb3活性研究，mtt 法测定od 值。结果如图2。 计算 鸡血藤水提物和有效组分的半数抑制浓度(ic50) 分别为87.17，9.14 μg/ ml， 治疗 指数(ti)分别为8.32和19.60，表明经过分离纯化除去了对细胞毒性大的部分，抗病毒活性成分得到了保留，有效组分的抗病毒活性与水提物相比抗cvb3 活性提高了约2倍。同时，根据有效组份的提取过程看，活性成分应是极性较大的物质。阳性对照为ribavirin的cc50为4 900 μg/ml，ic50为156.2 μg/ml，其ti为31.4。
3.3 有效组分的性质研究有效组分用水溶解后，进行α-2-萘酚-硫酸反应等反应对有效成分进行系统测试，各种显色剂进行显色，确定其成分性质，为下一进的分离纯化提供理论依据。结果见表5。
图2 鸡血藤水提物与活性组分的抗柯萨奇b3病毒实验效果
表5 有效组分的性质试验结果
反应名称及试剂现 象解 释α-萘酚-硫酸反应有明显的紫色环出现含糖类物质1%fecl3乙醇溶液溶液中有明显的紫色沉淀含酚类物质硅钨酸反应有沉淀产生含生物碱类物质碘化铋钾反映有黄色沉淀产生含生物碱类物质醋酐-浓硫酸反应发生颜色变化有皂苷类物质双缩脲反应溶液发生颜色变化，含有带有含氨基的化合物，并生成沉淀如氨基酸、肽类等
结果显示，虽然经过初步的纯化，但有效组分仍然是一混合物，其详细组成成分有待于进一步研究。
4 讨论
鸡血藤是一种传统的常用中药，在我国有着丰富的资源，其抗cvb3活性组分研究尚未见报道。我们的初步研究结果显示，在细胞水平上，通过对鸡血藤中抗cvb3 活性成分的研究，已经得到的有效组分在浓度为16 μg/ml 时可以完全抑制cvb3的致细胞病变效应，特别是其粗提物治疗指数达到了19.60，显示其较低的细胞毒性和较高的抗cvb3效果，表明鸡血藤提取物在抗cvb3方面可能具有良好的应用前景。
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