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血管紧张素II心肌细胞损伤作用

2015-07-30 10:06 来源:学术参考网 作者:未知

摘 要:目的 观察血管紧张素II刺激心肌细胞后SOD值及细胞凋亡率、并且探讨其机制。方法 1、取SD乳鼠心肌细胞做原代培养,分为空白对照组、AngII刺激组(分为不同浓度组);2、空白对照组不加任何刺激物。3、AngII组用浓度分别为40、60、80、100umol/L的AngII刺激乳鼠心肌细胞48小时;4、用化学比色法测定SOD活力,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果AngII刺激乳鼠心肌细胞48小时后细胞凋亡明显、SOD活性降低,且不同浓度AngII组间差异显著(P<0.05)。结论 血管紧张素II可引起鼠心肌细胞损伤,并随浓度增加而加重。

关键词:超氧化物歧化酶;血管紧张素II;心肌细胞;

        心肌细胞的凋亡和坏死在急慢性心力衰竭过程中起了重要的作用,在心力衰竭情况下RAAS(renin-angiotensin-aldosterone system)系统激活,血管紧张素II(AngII)增加,在心肌肥厚及心力衰竭的发生、发展中起着重要的调控作用。本试验在体外乳鼠心肌细胞的原代培养基础上,通过观察血管紧张素II刺激下心肌细胞SOD活力、细胞凋亡,探讨AngII损伤心肌细胞可能的机制。

一、 材料
 (一)细胞来源:新生SD乳鼠心脏分离心肌细胞做原代培养,SD乳鼠由苏州大学动物房提供。
(二)试剂  DMEM培养基、血管紧张素II、二甲基亚砜、胰蛋白酶、EDTA,SOD检测试剂盒,Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒。
(三)仪器 BB-5060型CO2培养箱、IX70型倒置相差显微镜、SW-CJ-1F型净化工作台、LDZ5-2型高速离心机、ULT1386-V34型-80℃冰箱、MDF-U332型-20℃冰箱、HZ-9211K恒温震荡器、DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱、721分光光度计、XW-80A旋涡混匀器、流式细胞仪(型号:FACSVantageSE)。
 二、方法
  (一)SD乳鼠心肌细胞的提取、纯化和培养
     采用无菌操作的方法取SD乳鼠心脏,用PBS缓冲液反复清洗,用眼科小剪刀剪成1-2m 大小的块状,加入0.25%的胰蛋白酶Ⅱ消化液中,置37℃培养箱孵化5-10min,将上层液体转至DMEM液管中,1000r/min离心3-5min,去上清,用DMEM培养基重悬细胞,保存于37℃CO2培养箱。将未消化完的心肌组织块再加入消化液,重复上述步骤,直至所有心肌组织消化完毕为止。将所得的心肌细胞转至70ml的细胞培养瓶中,37℃ CO2培养箱培养60~90min,待成纤细胞贴壁后,吸取上层细胞悬液至新的培养瓶中,计数后按5×105个/ml将细胞加至96胞培养板,置5%CO2和95%O2的培养箱37℃培养,同时观察和记录心肌细胞的生长状况。
  (二)试验分组(96孔板中对照组和AngII组分四个浓度组分别取10孔)
  1、对照组:仅用加入2%新生小牛血清的DMEM培养基。
  2、AngII组:DMEM培养基中分别加入浓度为20、60、80、100umol/L的血管紧张素II作用48小时。每种处理10个复孔,置于37℃含5%CO2饱和水汽培养箱中培养。
  (三)SOD、细胞凋亡率的测定
  1、标本收集
  细胞按上述不同刺激培养48小时后,吸取培养液上清,置于-20℃保存待测SOD;吸除培养板中培养基上清,剩余细胞收集后用于细胞凋亡率的测定。
  2、SOD测定、细胞凋亡率均按照试剂盒说明书步骤进行。
  三、数据处理:
  采用SPSS11.0统计软件进行分析,所有数据用均数±标准差表示,组间比较用方差分析,P<0.05认为差异有统计学意义。
  四、结果
  Ang-II 刺激乳鼠心肌细胞48小时后,培养上清液中SOD浓度明显低于空白对照组( P<0.05),且随AngII浓度加大SOD下降明显,不同浓度组间差异显著( P<0.05)(见表1)。各组细胞凋亡率明显高于空白对照组( P<0.05),且随AngII浓度加大凋亡率升高明显,不同浓度组间差异显著( P<0.05)(见表2)
  
    
   
   
 

  
讨论
     慢性心衰过程RAAS系统被激活,致血管紧张素II浓度增加,导致心肌损伤。可表现为细胞通透性增加,心肌酶(如CPKMB,ASTMB CTnI)外漏和心肌细胞凋亡、坏死。本文结果显示加入AngII后心肌细胞活力降低,细胞的凋亡率显著增加,与文献报告一致.Mol Cell Cardiol,2001,33 (5):995-100 3.
  . Nucleic Acids Res, 2000,28(24):4987-4997.

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