茶多酚对HL60/VCR细胞多药耐药的逆转作用

【关键词】 多药耐药;hl60/vcr;茶多酚;bcl2; bax

【摘要】 目的 探讨中药茶多酚(tp)对多药耐药细胞系hl60/vcr多药耐药的逆转作用。方法 hl60细胞反复暴露于浓度递增的长春新碱(vcr)培养液中,建立多药耐药细胞系hl60/vcr;不同剂量tp处理hl60/vcr细胞，mtt法检测tp对hl60/vcr 细胞多药耐药的逆转作用;流式细胞仪检测tp对hl60/vcr细胞p糖蛋白(pgp)，多药耐药蛋白(mrp)，人肺耐药蛋白(lrp)表达的影响;rtpcr检测tp对hl60/vcr 细胞bcl2基因表达的影响。结果 hl60/vcr细胞系对多种化疗药物产生耐药;pgp 在hl60/vcr 细胞中的相对荧光强度(rfi)明显高于hl60 细胞，是hl60 细胞的24.65倍;hl60/vcr的bcl2 mrna表达水平增高，bax mrna表达水平下降;5 μg/ml tp使hl60/vcr细胞对vcr、阿霉素(adr)、vp16的耐药逆转倍数分别为2.367、1.490和1.667;7.5 μg/ml tp使hl60/vcr细胞对vcr、adr、vp16的耐药逆转倍数分别为9.057、2.257和6.004;tp剂量依赖性地降低hl60/vcr细胞mrp表达的影响;5、7.5 μg/ml tp可下调hl60/vcr细胞bcl2 mrna表达水平。WWw.133229.COM结论 hl60/vcr细胞对多种抗癌药耐药，其多药耐药的机制可能与增加pgp的表达水平及增加bcl2/bax比值有关;tp对多药耐药细胞hl60/vcr具有逆转作用，可能的机制是降低pgp的表达水平，下调bcl2 mrna表达。

【关键词】 多药耐药;hl60/vcr;茶多酚;bcl2; bax

　急性白血病患者体内抗凋亡蛋白bcl2表达增高〔1〕，抑制肿瘤细胞凋亡，从而导致肿瘤细胞多药耐药(mdr)。han〔2〕发现，磷酸化的蛋白激酶(akt)通过上调bcl2表达，导致胃癌细胞的mdr。采用长春新碱反复短期暴露法处理人白血病细胞株(hl60),建立了mdr细胞系hl60/长春新碱(vcr)。茶多酚(tp)具有清除活性氧、自由基的功效，具有抗癌、抗心血管疾病、提高机体免疫功能、延缓衰老等功能。有研究发现〔3〕，tp及其单体表没食子儿茶素通过减弱mdr1基因表达，抑制p糖蛋白(pgp)atp酶活性，逆转人口腔表皮癌细胞株(kba1)的mdr性。tp对hl60/vcr基因表达的影响未见报道。本研究用不同浓度的中药tp处理hl60及hl60/vcr细胞，探讨tp逆转hl60/vcr细胞mdr的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　vcr(上海华联制药公司)、阿霉素(adr，连云港制药厂)、阿克拉霉素(acr，深圳万乐药业公司)、vp16(连云港制药厂)、高三尖杉酯碱(hht，杭州民生)、长春地辛(vds，杭州民生)，tp(浙江莫干山制药厂，纯度≥99%)。噻唑蓝(mtt，sigma公司)，逆转录酶，trizol试剂(invitrogen公司);rpmi1640(gibco公司);小牛血清(杭州四季青公司); 100 bp dna ladder(bebco公司);兔抗人pgp，兔抗人多药耐药蛋白(mrp)，兔抗人肺耐药蛋白(lrp)，异硫氰酸荧光素( fitc)标记二抗(中山生物技术公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞株及培养条件

　　hl60细胞株保存于本室。细胞于含10%新生小牛血清的rpmi1640培养液中，37℃,全湿度，5% co2培养箱培养。

　　1.2.2 mdr细胞系hl60/vcr的建立

　　〔4〕 取对数生长期hl60细胞,在含2 μg /ml vcr的rpmi1640完全培养液中，37℃，全湿度co2培养箱培养2 h，然后将细胞移至无药条件下培养，待细胞恢复生长后，反复用vcr处理，同时增加药物浓度，直到获得耐药性，维持培养于1 μg /ml的培养液中。进行各项实验前，细胞无药培养7 d。

　　1.2.3 mdr检测

　　选用vcr、adr、vp16、hht、vds、acr等6种药物进行检测。对数生长期hl60/vcr和hl60细胞悬液1×105/ml，接种于96孔板，每孔0.1 ml。每种化疗药物在100 μg/ml至0.01 μg/ml间按1∶10逐级稀释成6个浓度梯度，每种浓度各加5复孔。37℃,全湿度，5% co2培养箱培养48 h。mtt法计算出半数抑制浓度(ic50)及耐药倍数(rf)。rf=ic50(hl60 /vcr)/ic50(hl60)。

　　1.2.4 pgp、mrp、lrp表达测定

　　收集细胞，用磷酸缓冲液将细胞洗2次，加入抗pgp、mrp、lrp蛋白抗体40 μl，室温作用2 h，用磷酸缓冲液将细胞洗2次，加荧光标记抗体20 μl，室温作用2 h，用磷酸缓冲液将细胞洗2次，流式细胞仪检测。采用lysysⅱ软件分析、处理5 000个细胞，分析结果用相对荧光强度(rfi)表示，rfi=hl60/vcr管平均荧光强度/hl60管平均荧光强度。所有实验均重复3次，取其均值。

　　1.2.5 rtpcr检测bcl2,bax mrna表达水平

　　收集hl60/vcr和hl60细胞,抽提总rna并计算其浓度，70℃保存备用。rtpcr参照逆转录酶说明书，引物根据genbank提供的序列自行设计。引物：bcl2:5′tgtggccttctttgagt tcg3′，5′tcacttgtggctcagatagg3′(扩增产物278 bp);bax:5′gctctgagcagatcatgaagacag3′，5′cacaaagatggtcacggtctgc3′(扩增产物479 bp);βactin:5′gcggg aaatcgtgcgtgacatt3′，5′gatggagttgaaggtagtttcgtg3′(扩增产物236 bp，作为内参)。pcr条件：94℃变性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸40 s，扩增30个循环。取扩增产物至2%琼脂糖凝胶中电泳。

　　1.2.6 mtt法确定tp的逆转浓度

　　取对数生长期的细胞，在培养瓶中用培养液稀释到1×105/ml。tp作用的终浓度为2.5、5、7.5和10 μg/ml，另设空白对照组。取96孔板，每孔加入100 μl 细胞悬液，在37℃含5% co2的培养箱中培养过夜。吸去培养液，把含以上4个浓度tp的培养液分别加入96孔板，每种浓度设5个复孔，在37℃，5% co2培养箱培养48 h。在终止实验前每孔加入mtt 20 μl，继续培养4 h，每孔加入dmso 200 μl，混匀，酶标仪测定参考值为610 nm，测量值为570 nm，按以下公式计算抑制率：细胞抑制率=(1-实验组a值/对照组a 值)×100%。以对细胞增殖无明显影响的药物浓度为逆转浓度。

　　1.2.7 tp对hl60/vcr细胞的耐药逆转试验

　　细胞耐药性逆转试验：方法同细胞耐药性试验，只是在加入抗癌药物之前15 min先加入tp。计算hl60/vcr细胞对vcr、adr、vp16耐药的降低程度。逆转倍数(rf)的计算公式如下：rf=ic50(hl60/vcr)/ic50(hl60/vcr+tp)。

　　1.3 统计学分析

　　采用spss10.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用lsd检验。

　　2 结 果

　　2.1 hl60/vcr细胞耐药谱

　　hl60/vcr细胞不仅对原诱导药物vcr具有高度耐药性，耐药倍数(rf)为1 721，而且它们对化学结构和作用机制不同的其他抗癌药物也具有交叉耐药性。即对hht、vds也高度耐药。见表1。

　　2.2 hl60细胞和hl60/vcr细胞pgp，mrp，lrp的表达

　　pgp在hl60/vcr 细胞中的rfi明显高于hl60 细胞，是hl60 细胞的24.65倍。mrp、lrp 也有不同程度的增高，分别是hl60 细胞的1.36和1.04倍。见表2。

　　2.3 hl60，hl60/vcr细胞bcl2、bax mrna的表达

　　bcl2 mrna在hl60/vcr 细胞中的条带明显亮于hl60细胞，说明bcl2 mrna在hl60/vcr 细胞中的表达高于hl60细胞;而bax mrna的表达则弱于hl60细胞。见图1。　a.hl60细胞; b.hl60/vcr; c.100 bp dna marker，从上至下：2 000,1 800,1 700, 1 500,1 200,1 000, 900,800,700,600, 500,400,300,200, 100 bp图1 hl60、hl60/vcr细胞bcl2、bax mrna表达

　　2.4 tp对hl60，hl60/vcr细胞增殖的影响

　　7.5 μg/ml的tp及更低浓度的tp对hl60细胞和hl60/vcr细胞无明显细胞毒作用，其抑制率均小于10%。确定进行mdr细胞逆转实验的tp浓度为2.5、 5和7.5 μg/ml。见表3。

　　2.5 tp对hl60/vcr细胞mdr的逆转作用

　　分别加入5和7.5 μg/ml tp后，vcr、adr、vp16对hl60/vcr细胞的ic50及逆转倍数(rf)见表4。加入tp后，vcr、adr、vp16对hl60/vcr细胞的ic50明显降低，且呈浓度依赖性。5和7.5 μg/ml tp使vcr对hl60/vcr细胞的ic50由10.326 μg/ml分别下降至4.362 μg/ml 和1.14 μg/ml，逆转倍数分别为2.367和9.057，表明tp能逆转hl60/vcr细胞的mdr性。表1 不同药物对hl60/vcr和hl60的表2 hl60和hl60/vcr细胞pgp、mrp、lrp的表达

　　2.6 tp对hl60/vcr mdr相关蛋白质表达的影响

　　tp能剂量依赖性地降低mdr相关蛋白质的表达，以pgp的下调最明显，p<0.05;mrp与lrp的表达也有所下降，但无统计学意义。见表5。表3 tp对hl60，hl60/vcr细胞增殖的抑制作用表4 不同浓度tp对hl60/vcr细胞mdr的逆转作用表5 tp对hl60/vcr mdr相关蛋白质表达的影响

　　2.7 tp对hl60/vcr细胞bcl2 mrna表达的影响

　　分别加入2.5 μg/ml、5 μg/ml 和7.5 μg/ml tp后，hl60/vcr细胞bcl2 mrna的条带亮度剂量依赖性地下降，表明tp能下调hl60/vcr细胞bcl2 mrna的表达。见图2。a. 7.5 μg/ml tp;b. 5 μg/ml tp; c. 2.5 μg/ml tp; d. 0 μg/ml tp, e.100 bp dna marker, 从上至下：2 000,1 800,1 700, 1 500,1 200,1 000, 900,800,700,600, 500,400,300,200, 100 bp图2 tp对hl60/vcr细胞bcl2 mrna表达的影响

　　3 讨 论

　　化学治疗仍然是白血病及其他恶性肿瘤的主要治疗方法,然而在化疗过程中，mdr的产生不可避免,直接影响化疗效果。白血病细胞产生耐药的机制十分复杂，目前的研究结果认为白血病细胞产生耐药的机制可能包括：①糖蛋白介导的药物外排机制，使进入细胞内的药物减少，这些糖蛋白有pgp、lrp、mrp等。本文结果也显示pgp 在hl60/vcr 细胞中的表达明显高于hl60细胞，是hl60细胞的24.65倍。mrp、lrp也有不同程度的增高，分别是hl60细胞的1.36和1.04倍。②mdr的酶介导的机制，可能与dna拓扑异构酶ⅱ、谷胱甘肽转移酶等有关，这些酶具有解毒能力，减弱化疗药物对细胞的损伤。③细胞凋亡抑制基因的过表达与凋亡诱导基因的低表达或失活也是造成细胞耐药的一个重要原因。其中最引人注目的是bcl2家族蛋白中凋亡诱导蛋白和凋亡抑制蛋白的相互作用，其中bcl2和bax是两种相互作用与细胞凋亡密切相关的基因。将bcl2基因转入药物敏感细胞，可以抑制细胞凋亡并产生耐药性〔5〕，bax基因的高表达能够促进细胞凋亡。本研究显示结果显示，bcl2 mrna在hl60/vcr 细胞中的表达明显高于hl60细胞，而bax mrna的表达则低于hl60细胞。因此，本实验研究建立的hl60/vcr细胞的耐药机制与pgp表达增强及bcl2/bax比值增高有关，可作为白血病耐药机制及耐药逆转研究用的细胞。

　　目前已发现异搏定、环孢素a、三氟拉嗪等几十种具有逆转mdr的化合物，但由于这些逆转药物本身的毒性作用和在体内作用的差异限制了它们在临床上的应用。tp是从茶叶中分离提纯的多酚类复合体，以儿茶素为主要成分的强氧化剂，大多研究结果显示tp具有毒副作用低的特点，在防癌抗癌上起重要作用〔6，7〕。朱爱芝等〔8〕的研究表明tp不仅具有一定的抗癌活性，还具有mdr性逆转作用，可逆转mcf7/adr对adr的耐药性。汪清等〔9〕的研究发现，tp能明显增效化疗药物在膀胱肿瘤细胞内的浓度，增强化疗药物的敏感性。本研究表明，tp能逆转hl60/vcr细胞的mdr性，其机制可能与降低pgp的表达有关，通过降低pgp的表达，可抑制hl60/vcr向外排除化疗药物，增加细胞内化疗药物的积累，增强化疗的敏感性;此外，还可能与减少bcl2基因的表达有关。当bcl2/bax的比值下降时，促进细胞的凋亡。反之，凋亡被抑制。tp可剂量依赖性地降低bcl2 mrna的表达，使hl60/vcr细胞的抗凋亡因素减弱，促进hl60/vcr凋亡。总之，tp可能通过降低pgp及bcl2的表达，逆转hl60/vcr细胞的mdr性。tp的成分相当复杂，具体哪种起主要作用，有待进一步研究。

【参考文献】
　1 delpoeta g,venditti a，delprincipe mi，et al.amount of spontaneous apoptosis detected by bax/bcl2 ratio predicts outcome in acute myeloid leukemia (aml)〔j〕.blood,2003;101(6):212531.

　　2 han z，hong l，han y，et al.phospho akt mediates multidrug resistance of gastric cancer cells through regulation of pgp，bcl2 and bax〔j〕.j exp clin cancer res,2007;26(2):2618.

　　3 mei y，qian f，wei d，et al.reversal of cancer multidrug resistance by green tea polyphenols〔j〕.j pharm pharmacol,2004;56(10):130714.

　　4 石淑文,郭淑芬.四株人白血病多药耐药细胞系的建立及其生物学特性的初步研究〔j〕.中国小儿血液,1997;2(5):1937.

　　5 huang y，ibrado am，reed jc，et al.coexpression of several molecular mechanisms of multidrug resistance and their significance for paclitaxel cytotoxicity in human aml hl60 cells〔j〕.leukemia，1997;11(2):2537.

　　6 yang cs,chung jy,yang g.tea and tea polyphenols in cancer prevention〔j〕.j natr,2000;130(2):4728.

　　7 罗非君，胡 智，曹 亚,等.茶多酚诱导鼻咽癌细胞caspase3活化〔j〕.癌症,2000;19(12):10826.

　　8 朱爱芝,金 山,王祥云，等.茶多酚对肿瘤细胞多药耐药性逆转作用的研究〔j〕.北京大学学报(自然科学版) 2001;37(4):496501.

　　9 汪 清，辛殿祺，丁 义,等.茶多酚诱导ej膀胧肿瘤细胞凋亡并增加化疗药物毗柔比星的抗肿瘤协同作用〔j〕.中华实验外科杂志,2005;22(1):124.