【关键词】 迷迭香属;铁螯合剂;帕金森病
【摘要】 目的 观察迷迭香酸的铁离子螯合作用。方法 采用邻二氮菲分光光度法和western blot检测方法，分别观察不同浓度的迷迭香酸的铁离子螯合作用及对mes23.5细胞铁转出蛋白ferroportin1(fp1)的调节作用。采用四甲基偶氮唑盐(mtt)检测方法，观察不同浓度的迷迭香酸对mes23.5细胞存活率的影响。结果10-4～10-2 mol/l的迷迭香酸具有铁离子螯合作用(f=7.851，q=3.88～6.14，p<0.05)，10-5 mol/l的迷迭香酸没有表现出铁离子螯合作用(p>0.05)。10-5、10-4 mol/l的迷迭香酸对细胞无毒性作用(p>0.05)，10-3 mol/l的迷迭香酸使细胞存活率下降(f=4.948，q=4.04，p<0.05)。10-4 mol/l迷迭香酸不能调节mes23.5细胞内fp1的表达(f=0.333，p>0.05)。结论 迷迭香酸有明显的铁离子螯合作用，在治疗铁代谢相关疾病方面有着潜在的应用前景。
【关键词】 迷迭香属;铁螯合剂;帕金森病
iron chelation of rosmarinic acid du tingting, song ning, xie junxia, et al (department of physiology, shandong provincial key laboratory of pathogenesis and prevention of neurological disorders and state key disciplines: physiology, qingdao university, qingdao 266071, china); [abstract] objective to investigate the ironchelation properties of rosmarinic acid. methods orthophenanthroline spectrophometry was used to observe the iron chelation properties with different concentrations of rosmarinic acid, and western blots used to evaluate the regulation of ferroportin 1 (fp1) by rosmarinic acid in mes23.5 cells. mtt assay was used to observe the changes of cell viability with different concentrations of rosmarinic acid incubation in mes23.5 cell. results orthophenanthroline experiment indicated that the concentrations of 10-4-10-2 mol/l rosmarinic acid showed significant iron chelation properties (f=7.851,q=3.88-6.14,p<0.05), and that of 10-5 mol/l did not (p>0.05). mtt assay showed that 10-5 and10-4 mol/l rosmarinic acid did not have any toxic effects on mes23.5 cells (p>0.05). the cell viability decreased when treated with 10-3 mol/l rosmarinic acid (f=4.948,q=4.04,p<0.05). 10-4 mol/l rosmarinic acid had no effects on fp1 expression in mes23.5 cells (f=0.333,p>0.05). conclusion rosmarinic acid has an evident chelation of ferri ion, which is of potential prospect in the treatment of ironmetabolismrelated conditions.
[key words] rosmarinus; iron chelator; parkinson disease
帕金森病(pd)是一种多发于中老年的中枢神经系统退行性疾病，以运动不能、肌僵直、静止性震颤及姿势反射障碍为特征性表现[1]。WWw.133229.CoMpd主要病理学改变是黑质(sn)致密带多巴胺(da)能神经元丢失及伴发的纹状体轴突末梢da的耗竭。pd的发病过程有许多致病因子参与，如炎症递质的产生、da分解过程中氧自由基的大量释放、线粒体的损伤、da的毒性代谢产物、细胞凋亡以及神经营养因子的缺失等[2]。近来的研究发现，脑内铁代谢失衡所引起的铁水平升高与多种神经退行性疾病有关，在pd病人脑部特定的区域有明显的铁沉积，脑铁异常增高是da能神经元死亡的重要原因，铁的异常增高和铁诱发的氧化应激反应可能是pd发病机制中的关键因素[3]。因此，实验开发一种铁离子螯合剂和抗氧化剂日益成为研究热点，寻找天然、高效、低毒的抗炎、抗氧化、自由基清除剂及铁离子螯合剂成为了一种必然趋势。迷迭香酸(ra) 是一种水溶性的含多酚羟基的酸，因1958年首次从迷迭香植物中分离提取而得名[4]。ra具有抗氧化、清除自由基、抗炎、免疫调节、抗菌、抗病毒等多种生物活性且作用确切，可用于治疗自由基引起的多种疾患。研究已证实，ra对维生素cnadph 诱发的脂质过氧化均有较强的抑制作用，作用比维生素e强几百倍至千余倍，ra还能抑制山梨糖醇引起的细胞活性氧物质(ros)和no及一氧化氮合酶的增加，表明ra是一种很强的抗氧化剂[5]。但目前尚无ra铁离子螯合作用的研究，本实验拟采用邻二氮菲分光光度法和western blot检测方法，分别观察ra的铁离子螯合作用以及对mes23.5细胞铁转出蛋白ferroportin1(fp1)的调节作用，以期为ra用于与铁代谢相关疾病的防治提供可靠的实验依据。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
dmem/f12为gibco公司产品，fp1抗体为adi公司产品，其他的化学试剂均为sigma公司产品，ra由青岛大学医学院生物系提供，mes23.5细胞由美国休斯敦贝勒医学院神经科乐卫东教授友情馈赠。
1.2 细胞培养
将mes23.5细胞培养于含有体积分数0.05的胎牛血清、体积分数0.02的satio溶液、10 g/l的l谷氨酰胺、105 u/l青霉素和100 g/l链霉素的dmem/f12培养液中，置于体积分数0.05的co2培养箱中传代培养，每2～3 d传代1次。
1.3 邻二氮菲分光光度法检测铁离子螯合作用
取标准液(ra浓度分别为0、10-5、10-4、10-3、10-2 mol/l，nh4fe(so4)2·12h2o 0.1 g/l)2 ml，分别加入体积分数0.1的盐酸羟胺1 ml， 1.5 g/l的邻二氮菲2 ml，1 mol/l naac 5 ml，每加入一种试剂都应初步混匀。然后，用去离子水定容至50 ml，充分摇匀。最后，用自动酶标读数仪比色(波长510 nm)，测定吸光度(a)值，a值越小表示铁离子螯合能力越强。
1.4 mtt方法检测细胞存活率
用新鲜配制的dmem/f12培养液漂洗细胞1次，吹打制成单细胞悬液后离心，用dmem/f12培养液稀释成108/l的细胞悬液，每孔100 μl接种于铺有多聚l赖氨酸的96孔板中，每孔细胞数量约为104个，置于37 ℃、体积分数0.05的co2培养箱中培养24 h后，加入不同浓度的ra(10-5、10-4、10-3 mol/l)，对照组以配制的无血清dmem/f12培养液替换，置于37 ℃、体积分数0.05的co2培养箱中孵育24 h。培养结束后每孔加入5 g/l的mtt 20 μl， 37 ℃培养箱中培养4 h，弃上清后每孔加入二甲基亚砜100 μl，采用酶标检测仪测定570 nm处a值，以此来反映细胞的存活率。每组实验重复3次，取平均值。
1.5 western blot检测fp1的表达
用新鲜配制的dmem/f12培养液漂洗细胞1次，吹打制成单细胞悬液后离心，用dmem/f12培养液稀释成108/l的细胞悬液，每孔2 ml接种于铺有多聚l赖氨酸的6孔板中，置于37 ℃、体积分数0.05的co2培养箱中培养24 h后，加入10-4 mol/l ra，对照组以配制的无血清dmem/f12培养液替换，置于37 ℃、体积分数0.05的co2培养箱中孵育24 h后，提取蛋白。然后，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)实验，转膜，将膜浸于100 g/l tbst脱脂奶中，过夜，以封闭非特异性结合位点;用50 g/l tbst脱脂奶稀释一抗，fp1和βactin均为1∶4 000，孵育2 h，用tbst摇洗3次，每次10 min;用tbst稀释二抗，fp1和βactin均为1∶10 000，孵育1 h，用tbst摇洗3次，每次10 min。最后，显影定影拍照，并用天能分析软件对条带进行分析，将条带的强度和净a值的乘积作为蛋白的含量。以fp1/βactin表示fp1的表达水平。每组实验重复3次，取平均值。
1.6 统计学处理
实验结果以±s表示，采用ppms 1.5[6]软件进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 ra的铁离子螯合作用
对照组和10-5、10-4、10-3、10-2 mol/l ra处理组a值分别为0.133±0.005、0.126±0.010、0.116±0.008、0.109±0.008、0.100±0.010。10-4～10-2 mol/l ra处理组表现出铁离子螯合作用，与对照组相比差异具有统计学意义(f=7.851，q=3.88～6.14，p<0.05);但是10-5 mol/l ra处理组与对照组相比，差异无统计学意义(p>0.05);10-4、10-3、10-2 mol/l ra处理组之间相比，差异无统计学意义(p>0.05)。
2.2 ra对mes23.5细胞存活率的影响
对照组和10-5、10-4、10-3 mol/l ra处理组mes23.5细胞存活率分别为1.00±0.00、1.00±0.21、0.87±0.21、0.56±0.13。10-3 mol/l ra处理组细胞存活率明显下降，与对照组相比差异有统计学意义(f=4.948，q=4.04，p<0.05)。10-5、10-4 mol/l ra处理组细胞存活率与对照组相比，差异无统计学意义(p>0.05)。
2.3 ra对mes23.5细胞fp1的影响
对照组mes23.5细胞fp1表达水平为1.32±0.64，10-4 mol/l ra处理组为0.97±0.60，两组相比较差异无统计学意义(f=0.333，p>0.05)。见图1。
3 讨 论
ra是天然的抗氧化剂，其医学价值已经得到公认，尤其是它的抗氧化和抗炎作用。ra是非常强的过氧亚硝酸盐(onoo-)和其他自由基的清除剂，并且ra的其他生物活性在诸多方面均发挥作用，所以对其进行研究开发具有一定的意义。已有文献报道，ra可以通过与α突触核蛋白相互作用来抑制α突触核蛋白的聚集，也可以通过抗氧化作用抑制ros的生成，从而对pd起到保护作用[7]。
研究表明，铁在pd的发病中是一个关键因素。临床尸检结果、动物模型等都提供了越来越多的线索。经颅超声研究观察到pd病人sn铁水平增高早于临床症状的出现;且目前已证实除了少突胶质细胞内铁含量增高使sn脑区铁增高外，在残存的da能神经元内铁含量也明显高于对照组[8]。本实验室的前期工作证实sn内fe3+含量升高可使纹状体内da释放量和含量均降低,铁含量高可能参与pd的病理改变[9]。本实验运用邻二氮菲分光光度计法，通过检测铁反映ra的铁螯合能力，结果表明10-4、10-3、10-2 mol/l ra具有铁离子螯合作用，而10-5 mol/l ra 没有表现出此作用，证实了ra是一种铁离子螯合剂。
铁转运相关蛋白可以通过调节铁的转入、储存、转出等过程来影响细胞内的铁水平，因此，通过观察细胞内铁转运相关蛋白的变化可以反映细胞内铁水平的变化。那么，ra作为铁离子螯合剂对细胞内铁转出蛋白fp1的表达又有何影响呢?由于高浓度(10-3、10-2 mol/l) ra对细胞有毒性作用，因此我们选择10-4 mol/l ra处理mes23.5细胞，用以观察ra对fp1表达的调节作用。实验结果显示，10-4 mol/l ra处理组fp1的表达水平与对照组相比差异无显著性，说明10-4 mol/l ra不能调节细胞内fp1的表达。在fp1 mrna 5′未翻译区存在有功能性的铁反应元件(ire)，提示其受细胞内ire铁调节蛋白(irp)系统的调节。在细胞内低铁时，细胞内irp活性增强，导致fp1 mrna 5′未翻译区ire和irp的结合力增强，因而可以通过ire/irp理论下调fp1的表达。邻二氮菲实验结果虽然证实了ra具有铁离子螯合作用，但是它又对细胞内fp1的表达没有影响。这可能是由于：①正常情况下细胞内游离铁很少，大部分铁以铁蛋白和含铁血黄素的形式被储存，这些铁在正常情况下不能被激活，因此少量的游离铁与ra结合不足以激活irp调节的fp1的下调;②低浓度的ra铁离子螯合作用较弱，其尚不足以激活ire/irp调节的fp1的表达。
目前，已经有足够数据证明了在铁代谢相关疾病中铁起着重要作用，过量的游离铁，特别是fe2+可以通过fenton反应形成oh·，而oh·通过损伤蛋白质、核酸和含有大量未饱和脂肪酸的细胞膜，最终导致细胞死亡。本实验证实了ra是一种铁离子螯合剂，对其药理活性的进一步研究,必将使这种天然的铁离子螯合剂在治疗铁代谢相关疾病方面具有潜在的开发和应用前景。
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