【关键词】 银杏叶提取物;内皮细胞;细胞增殖;akt
【摘要】 目的 探讨银杏叶提取物(gbe)对血管紧张素ⅱ(ang ⅱ)致体外培养人脐静脉内皮细胞(huvec)损伤的保护作用。方法 将处于对数生长期的huvec分为正常对照组、angⅱ组及高、中、低3个gbe处理组，其中正常对照组用含0.5%小牛血清的dmem培养基培养，ang ⅱ组在正常对照组培养基基础上含ang ⅱ 10-8mol/l，gbe处理组在angⅱ组基础上分别加gbe 50、100、200 mg/l做为gbe低、中、高组，采用mtt法测定培养细胞增殖能力。并应用western印迹法检测各组细胞中磷酸化akt表达。结果 mtt法检测结果表明，ang ⅱ组细胞增殖能力明显高于正常对照组(p<0.05)，除gbe低剂量组外，gbe高、中剂量组a值均明显高于ang ⅱ组(p<0.05);western 印迹法检测各组培养细胞磷酸化akt表达结果显示，与正常对照组比较，ang ⅱ组磷酸化akt蛋白表达量明显降低(p<0.05)，gbe高剂量组磷酸化akt表达明显高于ang ⅱ组(p<0.05)，且与正常对照组比较，差异无统计学意义，gbe中、低剂量组磷酸化akt蛋白表达量明显降低(p<0.05)，但仍显著高于ang ⅱ组(p<0.05)。wwW.133229.COM结论 ang ⅱ导致血管内皮细胞增殖能力下降可能与其抑制磷酸化akt表达量有关，gbe可通过上调akt表达抵抗ang ⅱ引起的细胞损伤。
【关键词】 银杏叶提取物;内皮细胞;细胞增殖;akt
银杏叶提取物(gbe)具有清除氧自由基、拮抗血小板活化因子引起的血小板聚集和血栓形成、改善血液流变状态等药理作用〔1〕，其具体机制尚不清楚。研究表明，血管内皮细胞损伤不仅是动脉粥样硬化的始动因素，而且与冠心病、高血压等心血管疾病的发生和发展密切相关。因此，防止和逆转内皮细胞损伤、维持内皮细胞形态和功能的稳定性为众多学者所重视。本研究旨在探讨gbe对血管紧张素ⅱ(ang ⅱ)致体外培养人脐静脉内皮细胞(huvec)损伤的保护作用，并对其机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 细胞与试剂
huvec株(ecv304)，购自中科院上海细胞研究所;dmem培养基和小牛血清均为gibco公司产品;舒血宁(每支2 ml，折合gbe为7.0 mg，其中含总黄酮醇苷1.68 mg，含银杏内酯0.28 mg，批号：031209)为三九药业有限公司产品;兔抗人磷酸化蛋白激酶b(akt)、三磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)均为santa cruz产品;辣根过氧化物酶(hrp)标记羊抗兔igg为北京中衫金桥公司产品;聚偏氟乙烯(pvdf)膜及化学发光检测(ecl)试剂盒为millipore产品。
1.2 方法
1.2.1 huvec传代培养
冻存huvec复苏后，接种至25 cm2培养瓶， 待细胞生长汇合时，常规进行传代培养，隔日更换细胞培养液1次。
1.2.2 实验分组
将处于对数生长期的huvec分别用含0.5%小牛血清的dmem培养基培养24 h后，分为5组，分别为正常对照组，ang ⅱ组及高、中、低3个gbe处理组。其中正常对照组用含0.5%小牛血清的dmem培养基培养，ang ⅱ组在正常对照组培养基基础上含ang ⅱ 10-8 mol/l，gbe处理组在angⅱ组基础上分别加gbe 50、100、200 mg/l做为gbe低、中、高组。
1.2.3 培养细胞增殖能力测定
采用噻唑蓝(mtt)法测定培养细胞增殖能力。将细胞消化后，用含10%小牛血清的dmem培养液配成单个细胞悬液，以1×103个/孔接种至96孔板，每孔加培养液150 μl，培养24 h后小心弃去上清，按1.2.3分组情况分别加入条件培养基150 μl，每组设4个复孔。37℃、5% co2培养箱中培养24 h后，每孔加入mtt溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内上清，每孔加入150 μl 二甲基亚砜(dmso)，震荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在490 nm处测定各孔吸光度值(a)。
1.2.4 western 印迹法检测各组细胞中磷酸化akt表达
细胞经消化后计数，调细胞浓度以1×106个/孔接种至6孔板。待细胞80%融合后，加入含0.5%血清的培养基同步24 h后按1.2.3加入条件培养基，培养24 h，吸弃培养上清液，磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗后加入100 μl冰预冷的悬浮缓冲液〔0.01 mol/l trishcl(ph7.5)，0.1 mol/l nacl，0.001 mol/l乙二胺四乙酸(edta)，100 μg/ml苯甲基磺酰氟(pmsf)，1 μg/ml aprotinin〕反复吹打，待细胞充分裂解后，迅速加入等体积的2×十二烷基磺酸钠聚丙稀酰胺(sdspage)凝胶上样缓冲液〔100 mol/l trishcl(ph6.8)，200 mol/l dtt，4% sds，0.2%溴酚蓝，20%甘油〕，将样品置于沸水浴中加热5 min后，室温10 000 r/min离心10 min，将上清液用紫外法进行蛋白定量。取含30 μg总蛋白的细胞裂解产物进行12% sdspage电泳。停止电泳后，取出凝胶，于4℃ 100v条件下转膜1 h。然后用脱脂奶粉37℃封闭1 h，充分洗膜后加相应稀释的一抗溶液(磷酸化akt按1∶500稀释、gapdh按1∶2 000稀释)4℃过夜。充分洗膜后加入hrp酶标二抗(1∶2 000)，37℃与pvdf膜共孵育1 h，孵育结束后洗膜后将杂交膜与感光胶片安装好后于暗室内曝光，观察相应蛋白条带表达情况。用凝胶成像及分析系统分析蛋白显色的密度值，比较各组细胞akt/gapdh值。
1.3 统计学分析
采用spss16.0统计软件进行分析，实验数据以x±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用最小显著差法(lsd)。
2 结 果
2.1 各组细胞增殖能力比较
mtt法检测结果表明，正常对照组a值为1.49±0.04，angⅱ组a值为1.18±0.06，明显高于正常对照组，差异有统计学意义(p<0.05);除gbe低剂量组外，gbe高、中剂量组a值均明显高于angⅱ组，且差异有统计学意义(p<0.05)。见表1。
2.2 各组细胞磷酸化akt表达量比较
western印迹法检测各组培养细胞磷酸化akt表达。gapdh蛋白表达量为内对照，用图像分析仪进行分析，并计算akt与gapdh的比值，可见与正常对照组比较，ang ⅱ组磷酸化akt蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义(p<0.05)。gbe高剂量组磷酸化akt表达明显高于ang ⅱ组(p<0.05)，且与正常对照组比较，差异无统计学意义。与正常对照组比较，gbe中、低剂量组磷酸化akt蛋白表达量明显降低(p<0.05)，但仍显著高于ang ⅱ组，且差异有统计学意义(p<0.05)。见表1。表1 各组细胞mtt及western印迹结果
3 讨 论
血管内皮细胞具有重要的代谢和内分泌功能，其损伤及功能改变与动脉粥样硬化、 冠心病和高血压等心血管疾病的发生发展密切相关〔2，3〕。缺血损伤、氧化应激以及氧化型低密度脂蛋白等，都可诱导内皮细胞损伤、凋亡。有学者将huvec暴露于ang ⅱ 18 h，发现ang ⅱ呈剂量依赖性诱导huvec凋亡，若同时阻断血管紧张素i型(at1)和ⅱ型(at2)受体，ang ⅱ促凋亡效应被抑制，而阻断其中之一则对ang ⅱ介导的huvec凋亡无影响，表明ang ⅱ促凋亡作用可能由at1和at2共同参与的信号转导途径有关〔4〕。本研究应用体外培养huvec的方法，观察到10-8 mol/l 的ang ⅱ可导致血管内皮细胞增殖能力下降。
细胞增殖是由多种信号转导通路参与的复杂过程，磷酸肌醇3激酶(pi3k)/akt信号转导通路便是其中一条重要的通路。pi3k是一类特异性的催化磷酯酰肌醇(pi)3位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的激酶。akt主要负责由pi3k始动的生物信息的传导，akt处于pi3k/akt这个通路的中心环节。目前认为，pi3k/akt信号传导通路是独立于其他通路的一个新的信号转导系统，在细胞的凋亡、存活、增殖以及细胞骨架的变化等活动中发挥重要的生物学作用〔5〕。本研究结果显示，磷酸化akt在ang ⅱ损伤的huvec中呈明显低表达，且其表达量与huvec增殖程度有关，表明pi3k/akt途径可能在ang ⅱ介导的内皮损伤中起重要作用。
gbe的有效成分主要为黄酮类和萜内酯类化合物，不但具有扩血管作用，还有降血脂、抗凝血、清除自由基、抗炎、镇痛、抗肿瘤等作用。gbe已被广泛应用于心、脑血管疾病的预防和治疗。本研究主要从其抗内皮细胞损伤角度探讨其防治心血血管疾病的机制，结果显示，gbe组细胞增殖能力明显高于ang ⅱ组，表明gbe在维持huvec正常生长能力、抵抗ang ⅱ引起细胞损伤方面具有重要作用。本研究显示，gbe组磷酸化akt蛋白表达量明显高于ang ⅱ组，且与gbe的剂量有关，在gbe高剂量组磷酸化akt表达量与正常对照组比较无显著性差异，表明gbe抗内皮损伤作用可能与pi3k/akt信号转导通路有关。
【参考文献】
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