【摘要】 目的 测定不同种属包括大鼠、人体主动脉血管的生物力学特性，从而探讨心脏外科心肌保护基础实验与临床结果差异显著的原因。 方法 分别制备新鲜wistar大鼠和人体颈总动脉血管条，利用powerlab 4腔器官室检测装置，分别检测大鼠和人体血管对电机械耦联收缩刺激剂68 mmol/l 的高钾溶液对α受体激动剂去甲肾上腺素的收缩反应和舒张恢复反应。结果 ① 大鼠动脉血管对68 mmol/l 的高钾溶液具有很好的收缩反应，收缩反应具有可重复性;而人体动脉血管对高钾具有高反应性;② 大鼠和人体动脉血管对α受体激动剂去甲肾上腺素均具有反应性，对血管舒张剂硝普钠具有相似的舒张反应。结论 ① 人体与大鼠具有相似的受体介导血管收缩机制;② 人体与大鼠的电-机械耦联血管收缩反应明显不同，提示人体与大鼠具有不同的通道反应特性。
【关键词】 心肌保护;电-机械耦联;钾
comparative study on carotid aortic vascular sensitivitybetween human and rats
guan yu-long1, dong pei-qing2, wan cai-hong2, yang jing2, he mei-ling2
(1.department of cardiopulmonary bypass,cardiovascular institute and fuwai hospital,
chinese academy of medical sciences & peking union medical college,beijing 100037;
2.department of cardiopulmonary bypass,beijing anzhen hospital,capital university of
medical sciences, beijing heart, lung and blood vessel medical institute,beijing 100029,china)
abstract: objective aortic vascular sensitivity was compared between different species to search for possible causes of significant discrepancy between basic experiments and clinical observations. methods carotid arteries were harvested from anesthetized wistar rats and cadavers who died within 2 hours . the response to 68mmol/l kcl and noradrenalin was assessed for observation of vascular sensitivity to electromechanical coupling vasoconstrictor and receptor-mediated vasoconstrictor between rats and human. results (1) the arterial rings of rats possessed swift and repetitive response to 68 mmol/l kcl. the tension of rings restored to baseline when the rings were washed with fresh krebs-henseleit solution. the arterial rings of cadavers had persistent vasoconstriction and the tension did not restored after the incubation solution was switched into fresh krebs-henseleit solution. (2) the arterial rings from rats and cadavers possessed similar response to noradrenalin and sodium nitroprusside.conclusion human and rats have similar receptor-mediated vasoconstriction mechanism. the response to electromechanical coupling vasoconstriction is different between human and rats, which indicats human and rats possess different channel characteristic. so those may be the primary cause of significant discrepancy between basic experiments and clinical observations.
key words： cardioprotection;electromechanical coupling;potassium
体外循环(cardiopulmonary bypass,cpb)心脏直视手术的患者，在围术期会受到不同程度的干扰和损伤。Www.133229.coM为减轻术后脏器功能不全的发生，学者们曾应用不同实验动物进行了大量的实验研究，但我们发现，有些在动物实验中应用的方法和技术在临床应用时结果不尽相同。本实验通过比较大鼠和人体动脉血管的生物力学特性，揭示不同种属间组织结构和功能方面的差异，从而为临床应用提供帮助。
1 材料与方法
1.1 实验材料 wistar 大鼠(清洁级，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心 );人颈总动脉血管条(取自脑死亡供体)。
1.2 实验仪器 powerlab 4 腔张力检测仪;sartorius basicplus bp211d天平;jb-3型磁力搅拌器。
1.3 实验步骤
1.3.1 液体的配制 实验当日配制krebs-henseleit(k-h)溶液(mmol/l)：nacl 118，kcl 4.7，cacl2 2.5，kh2po4 1.2，mgso4(7h2o) 1.2，nahco3 25.0，glucose 11.0，ph 7.4;68 mmol/l k+溶液： kcl 68mmol，其他同k-h液;m199培养液：在无菌条件下配制m199 溶液(购自gibco brl公司)，放置于4℃冰箱中备用。
1.3.2 标本的制备 wistar 大鼠(体重250±10g，n=10)，10% 水合氯醛375 mg/kg 腹腔注射麻醉。取双侧颈总动脉血管，用眼科剪将血管条剪成3 mm长的血管环。取自人尸体的颈总动脉血管备用(n=10)，用眼科剪将血管条剪成3 mm长的血管环。
1.3.3 颈总动脉血管电-机械耦联反应测定 将制备好的大鼠、人颈总动脉血管分别悬挂于powerlab 4 腔张力检测仪的器官室挂钩上，调定大鼠血管基础张力为1.5 g，人颈总动脉血管基础张力为3.0 g，维持基础张力平衡1 h。分别在器官室内加入68 mmol/l k+溶液，连续记录血管张力，观测动脉血管对高钾的反应性，直至最大张力达平衡。使用k-h 液进行换液，使得血管张力降至基础水平。重复上述刺激3次。
1.3.4 颈总动脉血管α受体介导的血管收缩及非内皮依赖性舒张反应测定 血管平衡1 h后，大鼠血管使用68 mmol/l k+溶液进行预处理3次，人颈总动脉血管无须预处理，分别在器官室内加入10-5 mol/l的去甲肾上腺素。血管张力达平台期后加入10-5mol/l的硝普钠。
1.4 统计学处理 应用spss 13.0统计软件进行统计分析，记录两组不同血管材料在不同刺激条件下张力随时间的变化值。两组数据进行t检验，用±标准差(±s)表示。p<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 颈总动脉血管电-机械耦联反应结果 加入电-机械耦联收缩刺激剂68 mmol/l k+溶液后，大鼠颈总动脉血管张力缓慢上升，并在1 h内达峰值。以k-h液冲洗3次后，血管张力迅速下降，并在30 min内恢复至原有基础张力水平(1.52±0.03)g，与基础张力(1.52±0.02)g相比，p>0.05。再次加入68 mmol/l k+溶液，血管张力再次上升。电-机械耦联反应刺激具有可重复性，见图1。而人颈总动脉血管张力缓慢上升，并在1 h内达峰值。以k-h液冲洗3次后，血管张力无改变(7.51±0.19)g，与基础张力(2.52±0.04)g相比，p< 0.01，见图2。
2.2 颈总动脉血管α受体介导的血管收缩及非内皮依赖性舒张反应结果 受到10-5 mol/l的去甲肾上腺素刺激后，大鼠颈总动脉血管张力急速上升，20 min内即基本达峰值，之后缓慢上升，连续性观测1 h血管张力无衰减。加入硝普钠后，血管张力急速下降，在20 min左右即达基础张力水平(1.43±0.13) g，与基础张力(1.53±0.05)g相比，p>0.05，见图3。人颈总动脉在去甲肾上腺素作用下血管张力缓慢上升，30 min内达峰值。加入硝普钠后，血管张力缓慢下降，在30 min达基础张力水平(3.21±0.28)g，与基础张力(3.06±0.13)g相比，p>0.05，见图4。
3 讨 论
在心脏直视手术中，cpb和心脏停搏为心脏和大血管手术提供了安全的保证。但在心脏停搏期间，心肌的缺血缺氧导致再灌注损伤的产生，部分患者在体外循环后发生心功能低下、心律失常等，影响了手术的顺利恢复。为此，学者们在心肌保护方面展开了大量的研究和探索，包括心脏停搏液的改良、灌注方式的改进、心肌损伤机制的探索等[1-6]。但是文献中有关心肌保护的研究结果并不一致。在动物实验中得到较好结果的一些心肌保护药物(如腺苷等)，在临床观察中并没有明显增强心肌保护的效果[7-8]。动物实验中发现的缺血预处理技术，在动物实验中可以明显改善之后心肌耐受缺血缺氧的能力，但在临床实验中也是不能得到验证[9]。这种动物实验与临床观察结果之间的巨大差异越来越受到学者们的重视，但具体机制尚不明确[10-11]。
本研究选择大鼠和人类动脉血管作为实验材料，从血管生物力学角度研究可能造成心肌保护基础实验与临床观察差异的可能原因。本组实验由于采用了powerlab 4 腔张力检测系统，压力传感器的设置较传统电生理检测装置有很大改进，采用了计算机模拟量到数字量转换(a/d)系统，敏感度大大提高。
血管平滑肌细胞受到刺激兴奋后，通过肌细胞特有的兴奋-收缩耦联机制产生收缩反应。在基础实验中，一般采用高钾作为电机械耦联反应的刺激剂，其浓度从30 ～ 100 mmol/l不等，68 mmol/l k+溶液是比较常用的一种。据报道，68 mmol/l k+溶液可以在不同动物的不同血管产生强烈的收缩效应，并且没有脱敏现象。去甲肾上腺素作用于α肾上腺素能受体，受体分布广泛，因此是药理机械耦联反应实验中最常用的试剂之一，因此，选用这两种试剂作为生物力学实验的刺激剂。加入硝普钠观察血管的非内皮依赖性舒张反应。在电机械耦联实验中发现，大鼠对高钾有较强的耐受和调节能力，大鼠血管张力在去除刺激因素后迅速下降，说明细胞内存在快速的钙通道调节机制，从而降低细胞内钙离子浓度，引起血管张力下降。但其具体机制尚需要进一步的实验证实。在药理机械耦联反应实验中，人体血管与大鼠具有相似的α受体介导收缩反应和非内皮依赖性舒张曲线。但是人体血管上升(收缩)和下降(舒张)曲线更为平缓，说明收缩和舒张强度低于大鼠。这可能提示人体对药物具有一定的抵抗和适应能力。
尽管动物实验中经常采用高钾进行反复刺激，进行血管生物力学的检测。但是检测也显示，暴露于20 mmol/l的高钾溶液，冠状动脉内皮细胞一氧化氮的释放并未受到影响，但是内皮细胞衍生的超级化因子(edhf)介导的舒张作用减弱[12]。本组实验则通过生物力学的角度直接证实了高钾的这种不利影响。人颈总动脉受到68mmol/l k+溶液刺激后，血管张力持续增高，改变细胞外k+浓度并不能使张力降低。这说明高钾对人体血管的不良影响较大鼠更为明显，人与动物血管调节钾代谢的机制存在明显差异。这种现象在临床上将会明显影响心肌保护的效果，表现在：① 高钾引起心肌血管痉挛，影响心脏停搏液的均匀分布，使部分心肌代谢活动持续存在，加重心肌缺血。② 钙内流导致细胞内钙超载。由于心肌收缩最终都是改变细胞内ca2+的浓度。高钾刺激引起的血管张力持续增加说明，细胞内ca2+浓度较高，细胞会调动质膜上的通道或通过耗能的ca2+泵，从而调节细胞内的钙浓度。但这些过程大多数都是耗能过程，会加重细胞缺氧。③ 心肌血管的挛缩影响复灌后血液的复流。④ 影响复灌后正常电机械活动的恢复。由于细胞外高钾本身对心肌电活动的产生和传导有影响，如果复灌后血运恢复不畅，也会间接导致心律失常的发生。
因此，根据本实验结果，有必要在进一步的实验中探索大鼠和人体血管电机械耦联反应差异的内在因素，将对心脏停搏液的改良起到有益的指导作用。在选择心肌保护的实验模型和实验设计时，应考虑不同种属的差异性。
【参考文献】
[1] 黑飞龙,王寿世,曹焕军, 等. 阜外极化停搏液大鼠离体心肌保护效果研究 [j]. 中国体外循环杂志, 2008, 6(3):183-186.
[2] 卢向航，冉珂，徐军美，等. 延迟相吗啡预处理对兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用 [j]. 中国体外循环杂志, 2008, 6(3):180-182.
[3] allen bs. pediatric myocardial protection: a cardioplegic strategy is the "solution" [j]. semin thorac cardiovasc surg pediatr card surg annu, 2004, 7:141-154.
[4] hayashi y, ohtani m, sawa y, et al. minimally-diluted blood cardioplegia supplemented with potassium and magnesium for combination of 'initial, continuous and intermittent bolus' administration [j]. circ j, 2004, 68(5):467-472.
[5] 董培青, 孙衍庆, 杨璟, 等. 心脏直视手术外源性磷酸肌酸的心肌保护效果 [j]. 中华胸心血管外科杂志, 1997, 13(4):212-214.
[6] teshima y, akao m, jones sp,et al. cariporide (hoe642), a selective na+-h+ exchange inhibitor, inhibits the mitochondrial death pathway[j]. circulation, 2003, 108(18):2275-2281.
[7] shalaby a, rinne t, jarvinen o,et al. initial results of a clinical study: adenosine enhanced cardioprotection and its effect on cardiomyocytes apoptosis during coronary artery bypass grafting[j]. eur j cardiothorac surg, 2008, 33(4):639-644.
[8] korbmacher b, klein kk, sunderdiek u,et al. does adenosine pharmacologically precondition human myocardium during coronary bypass surgery[j]? j cardiovasc surg (torino), 2005, 46(3):285-290.
[9] reffelmann t, schwarz er, skobel ce, et al. ischemic preconditioning. does this animal experiment phenomenon have clinical relevance[j]? med klin (munich), 2000, 95(10):559-567.
[10] bolli r, becker l, gross g,et al. myocardial protection at a crossroads: the need for translation into clinical therapy[j]. circ res, 2004, 95(2):125-134.
[11] royston d, kovesi t, marczin n. the unwanted response to cardiac surgery: time for a reappraisal[j]? j thorac cardiovasc surg, 2003, 125(1):32-35.
[12] yang q, zhang rz, yim ap, et al. release of nitric oxide and endothelium-derived hyperpolarizing factor (edhf) in porcine coronary arteries exposed to hyperkalemia: effect of nicorandil [j]. ann thorac surg, 2005, 79(6):2065-2071.
