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HPLC测定人尿液三苯双脒次级代谢物对苯二甲酸浓

2015-07-10 08:42 来源:学术参考网 作者:未知

【摘要】   目的建立测定人尿液三苯双脒次级代谢物对苯二甲酸(tpa)浓度的高效液相色谱法(hplc)。方法 以阿魏酸为内标(internal standard, is),志愿者尿样稀释后经ultimate xbc18柱(4.6mm×200mm,5μm)、流动相甲醇-1%醋酸(35∶65,v/v)分离,在检测波长为240nm、流速为 0.8ml/min、柱温为30℃条件下采用hplc分析。结果在1~400μg/ml内,tpa与is的峰面积比值与浓度线性关系良好(r=0.9954),定量下限为1μg/ml,低、中、高浓度的相对回收率分别为(106.0±4.4)%、(107.4±4.2)%和(108.5±2.4)%,批内和批间相对标准偏差(rsd)小于8%。结论方法符合生物样品分析要求,可用于三苯双脒次级代谢物tpa尿液浓度的测定。

【关键词】 三苯双脒 对苯二甲酸 高效液相色谱法 尿

   terephthalic acid by hplc

  xu jie1,2, yuan guiyan1, wei chunmin1, wang benjie1, guo ruichen1

  (1. institute of clinical pharmacology, qilu hospital of shandong university, jinan 250012, china;

  2.department of bioengineering, zibo vocational institute, zibo 255013, shandong, china)

  to develop a hplc method for determination of tribendimidine metabolite terephthalic acid (tpa) concentration in human urine. methods diluted urine was separated on the ultimate xbc18 column (4.6mm×200mm, 5μm), eluted with methanol and 1% glacial acetic acid (35∶65, v/v) at 0.8ml/min and 30℃, and detected at 240nm with ferulic acid as an internal standard (is). results a good linearity was obtained from 1 to 400μg/ml (r=0.9954). the lower limit of quantitation (lloq) was 1μg/ml. the relative recoveries were (106.0±4.4)%, (107.4±4.2)% and (108.5±2.4)% at 3, 25 and 200μg/ml, and the intra and interbatch relative standard deviations (rsd) were less than 8% for all quality control samples. conclusion the developed hplc method is proved to meet the requirements of biological sample analyses, and is appropriate for determination of urinary tribenmidine metabolitetpa in human urine.

  key words: tribendimidine; terephthalic acid; high performance liquid chromatography; urine

  三苯双脒(tribendimidine)是新型广谱驱肠虫药[13],化学名为n,n′双[4′(1二甲氨基乙亚氨基)苯基] 1,4苯二甲亚胺,po后于体内迅速分解为对(1二甲氨基乙亚氨基)苯胺(p(1dimethylamino ethylimino) aniline,dadt)和对苯二甲醛(1, 4phthaladehyde),对苯二甲醛经过体内酶氧化,迅速转化为对苯二甲酸(terephthalic acid,tpa)自尿中排泄;血中无对苯二甲醛检出。wwW.133229.cOm国内外文献多报道三苯双脒临床应用或药效学,鲜有其人体内处置过程[4]。文献报道[56]人尿液对苯二甲酸测定中,尿样需经高氯酸沉淀蛋白,乙酸乙酯提取,流动相中加入离子对试剂进行分离,操作较复杂。本研究建立了一个方便可行、定量准确的人尿液 tpa浓度的hplc测定方法,适合人体三苯双脒次级代谢物对苯二甲酸排泄动力学研究。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 药品与试剂 tpa对照品(批号wf20070717,含量≥99%)购自国药集团化学试剂有限公司;内标阿魏酸(ferulic acid, 批号07739910,供含量测定用)购自中国药品生物制品检定所;三苯双脒肠溶片(200mg/片,批号0505226),由山东新华制药股份有限公司提供;甲醇购自美国baker公司(色谱纯,含量100.0%);冰醋酸购自美国tedia公司(色谱纯,含量≥99.7%);氢氧化钠购自山东化工研究院(分析纯,含量≥96.0%);水为市售娃哈哈纯净水。

  1.1.2 仪器 美国waters allience高效液相色谱仪,配有waters 2695 separation module,waters 2996二极管阵列检测器,empower build 1154色谱工作站;sorvall biofuge primo离心机,购自美国科峻仪器公司;xw80a型旋涡混合器,购自上海精科实业有限公司。

  1.2 方法

  1.2.1 色谱条件 色谱柱 ultimate xbc18柱(4.6mm×200mm,5μm);流动相甲醇-1%醋酸(35∶65,v/v);检测波长240nm;流速0.8ml/min;柱温30℃。

  1.2.2 tpa系列对照品溶液 取tpa对照品约0.1g,精密称定,加1%氢氧化钠溶液溶解并稀释制成浓度为2mg/ml的对照品储备液,4℃冰箱保存备用。以水稀释配成1000、500、100、20和10μg/ml的tpa系列对照品溶液。

  1.2.3 is溶液 取阿魏酸约0.25g,精密称定,加甲醇溶解并稀释制成浓度为0.5mg/ml的is溶液,4℃冰箱保存备用。

  1.2.4 尿样处理 取人尿液适量,5000r/min离心5min,0.45μm针筒过滤器过滤,取滤液60μl,加入is溶液70μl和水770μl,涡旋1min,取20μl进样。以内标法计算尿液中tpa浓度。

  1.2.5 受试者选择及尿样采集 选择符合入选标准的16名男性健康志愿者,试验前签署知情同意书。志愿者随机分为3组,试验前禁食一夜,于次日早晨7点分别空腹口服200mg(5人)、 400mg(6人)和600mg(5人)三苯双脒肠溶片,200ml温开水送服,服药1h后定时定量(100ml/h)饮水,2h后进统一低蛋白、低脂肪早餐。早、中、晚餐统一进食。收集服药前和服药后0~2,2~4,4~6,6~8,8~10,10~12,12~24h的尿液,记录尿液体积,取10ml 离心后-20℃保存,备测。

  1.3 统计学处理 分析方法精密度和准确度试验数据经excel 2003软件计算得到。志愿者不同时间段的尿药浓度及尿液体积经das2.0实用药代动力学程序(残余尿药量法)计算三苯双脒次级代谢物tpa经尿排泄速率常数(elimination rate constant, ke)和半衰期(halflife time, t1/2)。

  2 结 果

  2.1 专属性 取尿液,按“1.2.4”项下操作。tpa和is保留时间分别为9.8min和12.0min,尿中内源性物质不干扰tpa测定。对照品溶液、空白尿样、空白尿样加对照品和is及志愿者给药后尿样加is色谱图见图1。

  2.2 标准曲线 取空白尿液,分别加入tpa系列对照品溶液适量,配制浓度为1、2、10、25、100、250、400μg/ml的tpa尿样系列。按“1.2.4”项下操作,每个浓度测定5次。以尿样中tpa浓度(x,μg/ml)为横坐标,tpa与is峰面积比值y为纵坐标,采用加权(1/c2)最小二乘法[7]进行线性回归运算,得回归方程y=2.68e-002x-1.47e-003,r=0.9954,r2=0.9909。在1~400μg/ml内,tpa与 is的峰面积比值与浓度线性关系良好,定量下限为1μg/ml。

  2.3 精密度和准确度 分别用空白尿液配制浓度为3、25和200μg/ml的低、中、高3个浓度的质控样品,按“1.2.4”项下操作,每个浓度5样本于1d内测定,或每日测定1次,连续3d(每日为一批)。质控样品与标准曲线同时进行,以当日标准曲线计算质控样品浓度,计算批内、批间相对标准偏差(relative standard deviation,rsd),评价方法精密度。根据测定浓度计算相对回收率,评价方法准确度。精密度结果见表1。低、中、高3个浓度相对回收率分别为(106.0±4.4)%,(107.4±4.2)%和(108.5±2.4)%;rsd分别为4.1%、3.9%和2.2%。表1 低、中、高3个浓度的精密度

  3 讨 论

  本研究建立了阿魏酸为is的人尿液tpa浓度hplc测定法,该法简便、快速、灵敏、准确,符合生物样品分析要求,适合人体三苯双脒次级代谢物tpa排泄动力学研究。

  本研究尿样无须沉淀蛋白,经离心、过滤和稀释后直接进样,预处理方法简单,回收率高,干扰少,重复性好。分离机制采用离子抑制色谱,流动相为甲醇-1%醋酸(35∶65,v/v),无需特殊离子对试剂,杂质峰与tpa分离效果良好。本研究用内标法定量,较文献报道[56]的外标法误差小。is 曾试用阿司匹林、苯甲酸、水杨酸和甘草次酸,分离效果或分析时间不理想。以阿魏酸为is,尿液中杂质峰与tpa和is分离良好,且保留时间适中,有利于提高测定效率。

  三苯双脒口服后于体内迅速分解为dadt和对苯二甲醛,对苯二甲醛经体内酶迅速氧化成tpa自尿中排泄,血中无对苯二甲醛检出。作为国家一类新药,三苯双脒体内处置过程尚未完全清楚,其参与酶类、肠道菌群或反应类型有待进一步研究。文献报道[8]tpa经肾排泄存在分泌和重吸收机制,可能导致 tpa尿累积排泄率有较大个体差异,但尚需进一步研究证实。

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[8] tremaine l m, quebbemann a j. the renal handling of terephthalic

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