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人参皂苷对肝损伤的防治作用

2016-01-20 11:42 来源:学术参考网 作者:未知

  人参为五加科植物人参的干燥根,而红参则是人参经过高温炮制后得到的加工品。人参具有抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力及护心保肝等药理作用。由于乙醇在体内主要经肝脏代谢,其代谢物乙醛及代谢过程中产生的活性氧会对肝脏造成损害,长期饮酒和过量饮酒,会造成乙醇在体内堆积,对肝脏造成不同程度的损伤。而人参皂苷是红参的主要活性成分,《中国药典》和国家标准均以人参皂苷为红参的考核指标。近年来,有研究发现红参具有保肝功能[2-3],本文旨在研究人参皂苷提取物对小鼠酒精性肝损伤的防治作用,揭示作用机制,为红参的临床应用提供依据。

 

  材料与与仪器

 

  1.1 仪器

 

  Infinite M200pro 酶标仪(瑞士帝肯);Lecia-DM2500 微生物显微镜,德国 Lecia 公司。

 

  1.2 药物与试剂

 

  鲜人参,为 年生,产自吉林省抚松县,由长春中医药大学王淑敏教授鉴定为五加科人参属人参Panax ginseng C. A. Meyer 干燥根;联苯双酯滴丸(浙江万邦药业有限公司,批号 A02130407);56°北京红星二锅头酒(北京红星二锅头酒厂,批号20140224);ALT 试剂盒、AST 试剂盒、MDA 试剂盒、GSH 试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20150112);TG 试剂盒(浙江东瓯生物工程有限公司,批号 2015040104)

 

  1.3 实验动物

 

  清洁级 ICR 雄性小鼠,体质量 20~22 g,由吉林大学基础医学院动物实验中心提供,动物合格证号:SCXK-()2014-005.

 

  实验方法

 

  2.1 红参炮制

 

  称取鲜人参约 300 g,用纱布包好,放入蒸参箱,在 60 min 升温到 100 ℃后蒸制 6 h,蒸制完毕后置于 50 ℃烘干箱内烘干。将烘干后的红参研碎成粉,过 80 目筛。

 

  2.2 人参皂苷提取物(Ginseng saponin extracts,GE)制备

 

  称取红参粉末,加入 倍量 80%乙醇,超声提取(500 W,100 Hz)30 min,抽滤,滤渣加入 6倍量乙醇超声 30 min,滤过,合并滤液,40 ℃水浴蒸干,加入适量水溶解,即得人参皂苷提取物(人参总皂苷含量为 3.84%)4 ℃下保存待用。

 

  2.3 动物分组

 

  取清洁级 ICR 雄性小鼠 72 只,正常喂养 5 d后,将其按体重平均分为 组,分别为对照组、阳性组(联苯双酯)、模型组及 GE 高、中、低剂量组,每组 12 只。

 

  2.4 动物造模及给药

 

  给药剂量按照成人日均用药量与小鼠给药量进行剂量换算,除对照组每天 ig 等体积的蒸馏水外,其余各组 ig 给予 56°白酒,给药剂量为 0.2 mL/20g,1 /d,造模 5 d.给药组给予 GE,低、中、高剂量组每日分别给予 0.380.751.13 g/kg 生药材浓度的 GE,阳性对照组给予联苯双酯 0.90 mg/kg,给药后 1 h 给予 56°白酒,/d,连续 30 d.小鼠给药期间每周进行称质量并记录,并观察小鼠的毛色、饮食、行为及死亡情况。

 

  2.5 样本采集

 

  处理前禁食 12 h,给药及白酒 1 h 后,小鼠摘眼球取血,常温静置后待其凝固,3 000 r/min 离心15 min,取血清,?80 ℃保存待测。采血后,迅速剖取肝脏,用冷生理盐水洗净,滤纸吸湿后,称取肝脏湿重,计算肝脏系数(肝脏系数=肝质量/体质量)。取肝右叶做 HE 染色,肝左叶制备 10%肝匀浆,匀浆制备方法:用冷生理盐水冲洗肝脏至无血色,称质量,加入 倍量冷生理盐水机械匀浆,将匀浆液 2 500 r/min 离心 20 min,4 ℃,取上清。

 

  2.6 生化指标检测

 

  每组取同等样本量的小鼠血清及肝匀浆,严格按照试剂盒操作方法进行小鼠血清 ALTASTTG、肝匀浆 MDAGSH 含量测定。

 

人参皂苷对肝损伤的防治作用


  2.7 肝组织病理学检查

 

  取小鼠肝脏右叶置于10%中性福尔马林中进行固定,经一定梯度浓度的乙醇脱水、石蜡包埋、切片进行 HE 染色,用显微镜观察肝组织病理变化。

 

  2.8 数据处理

 

  应用 SPSS 19.0 统计软件进行统计分析,采用单因素方差分析,组间比较采用最小显着差数法(LSD),数据均以 x ±s 表示。

 

  结果

 

  3.1 小鼠状况观察

 

  试验期间,GE 中剂量组及阳性组死亡小鼠 4只,其余各组死亡小鼠 只。对照组小鼠精神状态正常,毛色正常,模型组小鼠毛色较差,造模期间,ig 给予白酒后 20 min 左右,出现醉酒状态,不自主行为增多,爬行不稳,有些小鼠呈现昏睡状态,给药组小鼠给予白酒20min 后,醉酒状态较模型组稍好。

 

  3.2 体质量及肝脏系数变化

 

  各组小鼠体质量无统计学差异,与对照组相比,模型组小鼠肝质量增大(P<0.05),表明长期饮酒和乙醇的堆积造成小鼠肝脏受损肿大,质量增加可能与肝脏内脂肪堆积或其他物质生成有关。给药组小鼠肝脏系数相较模型组有明显降低(P<0.05)GE 高、中、低剂量组均有降低,但组间变化趋势不明显,GE 对酒精引起的小鼠肝脏受损肿大有一定的缓解作用。

 

  3.3 对小鼠血清 ALTASTTG 的影响

 

  与对照组相比,模型组小鼠血清 ALT(P<0.05)AST(P<0.05)TG(P<0.01)含量明显升高;与模型组相比,GE 高、中剂量组 ALT 含量降低(P<0.01)GE 各剂量组均能降低 AST 和 TG水平(P<0.01),联苯双酯组可明显降低 ALTAST水平。但 GE 高、中、低剂量组组间呈现的量效关系不明显。长期白酒灌胃会造成小鼠血清 ALTASTTG 含量增高,GE 可明显降低血清 TG 的含量,对 ALTAST 含量降低有一定作用,说明 GE对小鼠酒精性肝损伤有一定保护作用。

 

  3.4 对小鼠肝脏 MDAGSH 的影响

 

  小鼠肝匀浆 MDA 含量结果显示,模型组小鼠MDA 含量高于对照组(P<0.01)GE 各剂量组MDA 含量低于模型组(P<0.01)。模型组 GSH 含量低于对照组(P<0.01)GE 各剂量组 GSH 含量高于模型组(P<0.01)GE 可降低 MDA 含量,增加 GSH 含量,说明其可在一定程度上抵御肝脏内的氧化作用,从而保护肝脏进一步损伤。

 

  3.5 病理观察结果

 

  正常组肝细胞结构正常,肝细胞条索排列整齐;模型组肝细胞变性坏死,有炎性细胞浸润,脂泡小而密集;联苯双酯组炎性细胞浸润和坏死程度减轻

 

  讨论

 

  本研究采用长期、固定剂量的酒精灌胃造模方法[4-5]来模拟长期饮酒的状态,形成慢性酒精性肝损伤模型。通过实验观察,长期灌胃白酒的小鼠,不自主行为增多,会出现嗜睡、四肢无力、食欲减退、呼吸衰竭等状态,模型组小鼠的生化指标也表明长期白酒灌胃引起的肝功能的损伤,长期、固定剂量的酒精灌胃引起小鼠慢性酒精性肝损伤是可行的。

 

  ALTAST 是检验肝脏损伤的一个重要指标,正常血清里 ALTAST 含量极少,只有在肝细胞死亡破裂后肝细胞内的 ALTAST 才会释放入血,血清中 ALTAST 含量增加说明肝脏出现炎症。乙醇经肝脏代谢过程中产生的活性氧会直接对肝细胞造成氧化损伤[6],形成过脂质氧化产物--MDA,其含量是细胞氧化损伤的一个重要检测指标。模型组小鼠肝组织 MDA 含量高于正常组,GSH 含量低于正常组,肝脏长期的酒精代谢会造成肝脏内氧化物质的增多,还原物质减少,造成肝细胞氧化损伤。

 

  同时肝脏脂质过氧化会产生脂肪酸的氧化,影响肝脏微管功能,致使肝脏内 TG 代谢障碍,长期的乙醇摄入,不仅增大了小鼠的肝质量、肝脏系数,也致使模型组小鼠较正常组小鼠 TG 的量明显增多。

 

  红参醇提液中的成分主要是人参皂苷,红参中含有 20 多种人参皂苷,如人参皂苷 ReRb1Rh1Rh2Rd 等,其人参皂苷 Rg3Rg2Rh1的含量高于白参[7].研究发现人参皂苷 20 (S)-人参皂苷 Rg3可明显抑制肝损伤小鼠 ALTAST 的酶活性[8],人参皂苷Rb1可明显降低大鼠肝微粒体细胞色素P450酶与 NADPH-P450 的活性[9],人参皂苷 Rh2可抑制肝纤维 DNA 的合成[10]等。通过本研究发现,GE 可明显降低长期白酒灌胃小鼠血清中 TG 的含量,对降低其 ALTAST 作用不明显,对抑制肝脏内 MDA的含量,增加 GSH 含量有一定作用,对长期饮酒所造成的肝损伤有一定的预防和保护作用,从而阻止肝脏向纤维化进一步恶化。GE 中、高剂量组与模型组的病理观察比较,GE 可在一定程度上抑制肝细胞炎症发生,但抑制效果不明显,但可以显着减少小而密集的脂肪泡数量,GE 中、高剂量组可明显抑制肝脏内的泡样损伤。GE 可能主要通过抑制体内活性氧对肝脏脂质过氧化、减少肝脏脂肪堆积这一途径来避免肝脏受损。

 

  综合以上结果,人参皂苷提取物对小鼠酒精性肝损伤有一定的保护作用,以中、高剂量效果最好,但红参保肝机制尚不明确,此研究为红参的保健开发和治疗酒精性肝损伤提供了一定的参考。

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