【摘要】 目的: 探讨黏着斑激酶(fak)表达水平对结直肠癌细胞增殖及运动的影响。方法: 针对fak基因不同靶点设计sirna序列, 构建sirna重组子, 转染caco2细胞, 以rtpcr和免疫细胞化学方法检测fak mrna和蛋白表达变化及时间效应, 同时检测fak基因敲低对caco2细胞的凋亡、 增殖及迁移的影响。结果: fak sirna导入caco2细胞后, fak mrna和蛋白表达水平明显下调, 细胞增殖及迁移能力受抑, 呈时间依赖关系, fak mrna水平下调在转染后48 h达到最大。结论: fak sirna可有效抑制靶基因表达, fak表达水平下调后caco2细胞的增殖及运动明显受抑制。
【关键词】 小干扰rna; 结直肠癌; fak; 细胞增殖; 细胞运动
effects of fak expression level on proliferation and motility of colorectal carcinoma cells
pan ning, zhang airan, mu maosen, hou yingchun*
lab of tumor cellular and molecular biology, college of life sciences, shaanxi normal university, xi’an 710062, china
[abstract] aim: to investigate the effect of sirna targeting fak gene on proliferation and motility of colorectal cancer. methods: recombinant plasmids that produced sirnas targeting fak were designed and cloned, then transfected into caco2 cells. the changes of fak expression levels were examined by rtpcr and immunocytochemistry. the effects of fak gene knockdown on apoptotic morphological changes, proliferation, and motility were investigated. results: recombinant plasmids targeting fak were successfully constructed, fak mrna and protein level was silenced in caco2 cells significantly. the inhibition of mrna level was achieved maximal at 48 h post transfection with time dependent. the ability of proliferation and motility of caco2 cells were significantly decreased. conclusion: plasmidmediated fak sirna could inhibit fak gene expression. the proliferation, motility and apoptosis were inhibited effectively, which suggested that fak expression is closely associated with the proliferation, motility and apoptosis, etc. the results may be used as the reference for gene therapy of colorectal cancer.
[keywords]small interfering rna; colorectal cancer; fak; cell proliferation; cell motility
近年来以黏附相关因子为靶点的治疗成为基因治疗研究的新策略[1], 黏着斑激酶(focal adhesion kinase, fak)是近年来发现的细胞黏附介导的信号通路的重要因子, 作为胞内信号蛋白酪氨酸激酶, 于1992年被独立鉴定为src癌基因的底物。wwW.133229.coMfak的相对分子质量(mr)为125 000, 定位于人染色体8q24, 与cmyc基因座接近, 此基因座在人癌细胞中往往被激活而强化[2]。fak作为信号转导的关键分子, 可传递由胞外到胞内的多种信号, 其在结肠癌中表达升高而在正常组织细胞中表达呈弱阳性的特点开始引起研究人员的关注[3]。有研究显示, fak基因在结直肠癌组织中表达升高[4], 并与癌细胞增殖、 侵袭转移密切相关, 但作用机制还不明确。本实验将靶向fak基因的sirna表达载体导入caco2细胞, 探索fak sirna对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响并初步探讨其作用机制, 为结直肠癌基因治疗积累实验资料。
1 材料和方法
1.1 材料 人结直肠癌细胞株caco2购于美国atcc。重组质粒pu6h1gfp/faksirna为本实验室设计、 百奥生物技术有限公司(南通)构建, 大小为5.5 kb, 经测序正确。限制性内切酶hind ⅲ购自neb公司。脂质体lipofectamine 2000、 trizol试剂均为美国invitrogen公司产品。rpmi1640培养基购自美国gibco公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。四甲基偶氮唑蓝(mtt)购自美国amresco公司。rt007 amv反转录酶购自杭州博日科技有限公司。fak、 gapdh引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。针对fak的单克隆抗体(mab)购自santa cruz公司。sp免疫组化试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。hoechst 33258购自南京凯基基因有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 sirna的设计及构建 利用ambion sirna在线软件设计了2条针对fak的sirna: sifak1: 5′gggcagacgagaccacactga3′; sifak2: 5′gaaatggaagaagatcagcgct3′; 错义对照序列sirnascr: 5′gcatctaaggtatcgttgtggctc3′。经blast比对证实与人其它基因无同源性后构建合成sirna表达载体, 双启动子u6和h1之间插入人fak及错义sirna靶序列。
1.2.2 细胞转染 于6孔培养板, 将caco2细胞接种于无抗生素、 含100 ml/l胎牛血清的rpmi1640培养液, 细胞接种密度: 2×105/孔, 饱和湿度培养24 h。参照lipofectamine 2000说明书进行转染优化, 转染后6 h更换完全培养基。实验分为: 正常对照组(未转染的caco2)、 错义sirnascr组(非特异性sirna转染)、 干扰组sifak1、 sifak2。
1.2.3 gfp表达检测及转染效率评价 转染后细胞于激发波长为488 nm的荧光倒置显微镜下检测gfp的表达情况。以放大100倍的视野为标准, 计5个视野表达绿色荧光的细胞数和总细胞数, 求gfp表达率: gfp表达率=发绿色荧光细胞数/细胞总数×100%。
1.2.4 细胞凋亡形态学检测 取对数生长期细胞以2×105/孔接种于铺有无菌盖玻片的6孔板中, 每组爬片4张, 转染48 h后弃培养液, pbs洗3次, 40 g/l多聚甲醛4℃固定15 min, pbs洗3次, 吸净液体, 每孔加入200 μl hoeschst 33258工作液, 避光孵育10 min, pbs漂洗封片, 荧光显微镜下随机选取高倍视野进行拍照, 激发光波长为365 nm。
1.2.5 rtpcr检测 收集转染后24、 48、 72、 96 h细胞, 各组细胞总rna按trizol试剂说明书提取。将总rna(0.5 μg)行10 μl反转录体系。取cdna再进行25 μl pcr反应。pcr循环参数为: 95℃预变性2 min; 94℃变性40 s, 46℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 共28个循环(gapdh: 18个循环), 于72℃延伸10 min。fak上游引物: 5′gcgtctaatccgacagca3′, 下游引物: 5′gccgacttccttcaccat3′, 扩增产物为445 bp; 内参gapdh上游引物: 5′aatcccatcaccatcttcca3′, 下游引物: 5′cctgcttcaccaccttcttg3′, 扩增产物为580 bp。各取5 μl扩增产物, 经15 g/l琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像仪下观察结果及照相, bandscan 5.0进行条带分析, 检测各组fak与gapdh的灰度比值表示fak mrna表达水平变化, 比值越高说明目的基因表达越高。
1.2.6 细胞增殖检测 调整细胞密度为6 000个/孔, 接种至96孔板, 设blank组(只加完全rpmi1640培养液)、 sirnascr组、 正常对照组、 干扰组(sifak1、 sifak2), 每组每个时间点设6个复孔。培养24 h后弃上清, 进行转染(脂质体: 0.5 μl, dna: 0.2 μg)。于孵箱中继续培养24、 48、 72、 96 h后每孔加入mtt(1 g/l)15 l, 37℃、 50 ml/l co2避光孵育5 h, 再加入100 μl dmso振荡10 min, 酶标仪562 nm处测定各孔a值。生长抑制率=(1-处理组平均a值)/正常对照组平均a值×100%。
1.2.7 细胞迁移检测 于6孔板内按上述方法进行转染, 培养24 h后用外接真空泵的1 ml移液枪头(直径1.5 mm)垂直于6孔板板底分别打孔, pbs清洗2次, 更换完全培养液。分组同1.2.2, 40倍倒置显微镜下照相。于转染后48、 72、 96、 120 h继续照相, gene tools软件测定每孔各时间点面积。迁移率=(1-该时间点损伤面积)/原始损伤面积×100%。
1.2.8 免疫细胞化学检测 将细胞接种于铺有无菌盖玻片的6孔板中(1.5×105/孔), 每组爬片4张。设阴性对照组(pbs代替一抗)、 sirnascr组、 正常对照组、 sifak1和sifak2共5组。转染48 h后取盖玻片用sp试剂盒检测, fak mab稀释度为1∶300, 避光条件下, dab显色, 三蒸水冲洗停显, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 取出盖玻片置于载玻片上, 胞质出现棕褐色为阳性染色。中性树胶封片后, 每组随机选取10个高倍视野(×200), 进行图像采集。
1.2.9 统计学分析 数据以x±s表示, 采用spss15.0软件进行方差分析。p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组质粒pu6h1gfp酶切鉴定 用omega无内毒素质粒小提试剂盒扩增并纯化质粒, 经hind ⅲ 酶切鉴定, 可见质粒可被切割成大约5.5 kb的线性片段, 结果完全正确(图1)。
2.2 转染效率 经优化的脂质体条件转染后, gfp表达率为(44.59±2.71)%。
2.3 细胞凋亡的形态学观察 经hoechst 33258染色可见正常对照组细胞染色质为弥漫均匀的低强度荧光, 无明显凋亡特征(图2a); 经sifak1和sifak2组转染细胞48 h后, 细胞表现出典型的凋亡形态学变化, 胞核呈浓染致密的固缩形态、 断裂成块、 呈颗粒状亮蓝色荧光, 且有少量凋亡小体出现(图2d、 e中箭头所示)。脂质体组及sirnascr组均没有出现明显的凋亡形态学改变(图2b、 c)。因此可得出脂质体试剂及pu6h1gfp载体对转染无明显影响, 排除假阳性的干扰。
2.4 fak mrna表达变化 转染caco2细胞于24、 48、 72、 96 h后检测sirna敲低fak mrna水平表达的时间效应关系, 并确定敲低效果最好的1条序列。rtpcr结果显示, 各组内相应内参gapdh的条带基本一致, sifak1和sifak2组fak mrna水平低于正常组和sirnascr组, 且敲低效应在转染后24～48 h范围内呈时间依赖性降低, 至48 h降到最低(p<0.01, 图3)。两个sifak组均不同程度下调fak 基因的mrna表达水平, 其中以sifak1干扰效果最为明显。sirnascr组和正常组间fak mrna表达水平在转染后各时间点无统计学意义。
2.5 细胞增殖状况 mtt法检测表明, sifak1和sifak2组细胞增殖抑制率明显增加(图4)。与正常对照组相比, sifak1和sifak2对细胞增殖的抑制率在转染后24～72 h均有统计学意义(p<0.01)。随着sifak1和sifak2对细胞作用时间的延长, 抑制效果越明显, 在转染后48 h时达到最高。其中sifak1的抑制作用更强。sirnascr组与正常组在各时间点细胞增殖差异无统计学意义。
2.6 细胞迁移状况 与正常组相比, 特异性sifak1、 sifak2组使caco2细胞的迁移率明显降低(p<0.01), sirnascr组与正常组间无统计学意义(图5)。其中sifak1组对细胞迁移能力具有更强的抑制效果, 与mtt结果一致。
2.7 fak蛋白表达变化 免疫细胞化学方法检测结果显示, 正常组fak表达多位于胞质, 呈棕褐色, 强阳性表达, 而sifak1、 sifak2组细胞中fak蛋白的表达明显减弱(图6)。imagepro plus 6.0图像分析各组的a值, 转染后48 h sirnascr组、 正常对照组、 sifak1及sifak2光密度分析结果分别为0.223±0.006、 0.254±0.002、 0.059±0.006、 0.079±0.008。可见转染后48 h两个干扰组的蛋白表达明显被抑制(p<0.01), pbs阴性对照组、 sirnascr组与正常组间差异无统计学意义。
3 讨论
fak作为src癌基因的底物, 位于整合素富集的黏着斑处, 与多种信号分子相互作用, 介导多种细胞表面受体激活及信号传输来调控细胞骨架组建、 细胞增殖、 凋亡及存活、 细胞转移及入侵等, 最终参与肿瘤的发生。有研究表明, 在正常结直肠上皮细胞中fak表达呈弱阳性或阴性[5], 这与维持上皮细胞的生理功能是不可缺少的; 而在结直肠癌相关的细胞中fak表达明显升高, 说明其表达上调可能是结直肠癌具有恶性表型的早期事件。因此, fak作为肿瘤发生进程相关的关键分子可能成为肿瘤治疗的靶点, 而抑制fak的表达则有望成为肿瘤基因治疗的新热点。针对fak基因的反义寡核苷酸治疗结直肠癌的研究已有报道[6]。rnai是近年来快速发展的一种高效的基因沉默技术, 并作为一种关键技术应用于抗肿瘤、 基因功能研究[7]。
本实验以caco2细胞为研究对象, 采用针对fak mrna的特异性sirna重组表达质粒进行转染。rtpcr显示, 所设计的两个sifak重组质粒均能使其mrna水平下降, 其中以sifak1干扰效果更强, 在转染后48 h敲低效果最明显, 说明sirna对fak的抑制作用可能有时相性。而错义组则没有上述作用, 从而另一方面证明rna干扰的特异性。同时免疫细胞化学检测结果也显示转染后48 h sifak1对细胞fak蛋白抑制更明显。
细胞增殖和迁移在多种恶性肿瘤的病理生理过程中起重要作用。有研究表明[8], 活化的fakrasmapk是促进细胞迁移和增殖的重要信号通路。本研究中, 细胞增殖及迁移实验表明, 靶向fak基因干扰caco2细胞后, 细胞贴壁能力降低, 变圆易脱落, 细胞的增殖及迁移明显受抑, 因此我们推测fak基因表达受抑可使fakrasmapk信号通路受阻, 最终导致细胞增殖及迁移能力降低, 提示fak基因可能是结直肠癌肿瘤治疗的一个新靶点。相反sirnascr组对细胞的增殖及迁移无明显影响, 因此可以断定质粒载体pu6h1gfp可以作为安全有效的基因载体。近年来有关研究表明fak与肿瘤细胞的凋亡相关。huang等[9]发现fak通过活化pi3k/akt及mapk/erk1/2信号存活通路而引发nfκb活化, 最终阻断caspase3级联反应, 使细胞凋亡受抑。因此fak的表达与凋亡密切相关。本实验初步研究结果显示, 通过hoechst荧光染色发现sifak转染caco2细胞48 h后细胞呈现凋亡的形态学变化: 核致密浓缩, 染色体断裂, 并出现凋亡小体等特征。从分子机制来说, faksirna可能通过下调fak mrna和蛋白表达水平而促使caco2细胞凋亡。
实验中2个sifak重组质粒对靶基因的抑制效应不同, 其中以sifak1抑制fak基因mrna、 增殖及迁移的作用最为明显, 这种针对同一基因的不同靶点而产生的不同干扰效果, 可能与位置效应有关[10]。因此说明利用rna干扰进行肿瘤临床治疗要对干扰序列进行筛选。
综上所述, fak与肿瘤的发生、 发展密切相关, 我们的初步研究结果表明, 干扰fak基因表达后使caco2细胞增殖、 迁移力明显减缓、 细胞出现凋亡等现象, 且fak基因表达受抑后胞质形态结构受损, 其机制可能与抑制caco2细胞fak mrna和蛋白表达水平有关。因此靶向抑制fak基因的表达, 可能是结直肠癌治疗的有效途径。此研究为rnai在肿瘤治疗方面奠定了实验基础, 也为临床研究和进一步的治疗研发提供了更多的依据。
【参考文献】
[1] schmidmaier r, baumann p. antiadhesion evolves to a promising therapeutic concept in oncology[j]. curr med chem, 2008, 15(10): 978-990.
[2] 潘 宁, 章蔼然, 侯颖春. 黏着斑激酶活化与肿瘤进程研究进展[j]. 现代肿瘤医学, 2008, 16(12): 2222-2227.
[3] 黄培新, 刘 恒, 钟敏章, 等. 黏着斑激酶在结肠癌细胞中的表达及对其迁移的影响[j]. 中国中西医结合消化杂志, 2006, 14(4): 257-260.
[4] lark al, livasy ca, calvo b, et al. overexpression of focal adhesion kinase in primary colorectal carcinomas and colorectal liver metastases: immunohistochemistry and realtime pcr analyses[j]. clin cancer res, 2003, 9(1): 215-222.
[5] cance wg, harris je, iacocca mv, et al. immunohistochemical analyses of focal adhesion kinase expression in benign and malignant human breast and colon tissues: correlation with preinvasive and invasive phenotypes[j]. clin cancer res, 2000, 6(6): 2417-2423.
[6] walsh mf, thamilselvan v, grotelueschen r, et al. absence of adhesion triggers differential fak and sapkp38 signals in sw620 human colon cancer cells that may inhibit adhesiveness and lead to cell death[j]. cell physiol biochem, 2003, 13(3): 135-146.
[7] jiang f, caraway np, li r, et al. rna silencing of sphase kinaseinteracting protein 2 inhibits proliferation and centrosome amplification in lung cancer cells[j]. oncogene, 2005, 24(21): 3409-3418.
[8] margadant c, van opstal a, boonstra j. focal adhesion kinase signaling and actin stress fibers are dispensable for progression through the ongoing cell cycle[j]. j cell sci, 2007, 120(pt1): 66-76.
