Ad5F35LMP2重组腺病毒的构建

【摘要】 目的：构建ad5f35lmp2重组腺病毒。方法：分别以ecor ⅰ单酶切pshlmp2和pdc316，将lmp2目的基因片段和线性化的pdc3l6连接，克隆构建pdc3l6lmp2，以pcr和酶切的方法鉴定插入方向正确。pdc3l6lmp2与腺病毒骨架pbhgfiber5/35共转染293细胞构建重组腺病毒ad5f35lmp2，pcr及间接免疫荧光进行鉴定。结果：经pcr和酶切鉴定证实pdc3l6lmp2构建成功。pdc3l6lmp2与腺病毒骨架共转染293细胞后见明显的毒斑，说明二者在293细胞中同源重组并包装成功。经pcr证实重组腺病毒ad5f35lmp2构建完成，间接免疫荧光鉴定lmp2蛋白能在细胞膜上有效表达。结论：本实验成功构建了含eb病毒lmp2全序列的ad5f35lmp2重组腺病毒，为下一步进行该重组病毒生物安全性能和生物学功能研究及今后应用ad5f35lmp2重组腺病毒对鼻咽癌患者进行基因免疫治疗奠定了基础。

【关键词】 鼻咽癌 重组腺病毒 基因免疫治疗

　　construction and identification of recombinant adenovirus ad5f35lmp2 containing lmp2 gene
　
　　mo wuning, zhou ling, wu xiaobing, wang zhan, tang anzhou, huang guangwu, zeng yi.

　　first affiliated hospital，guangxi medical university, nanning 530021，china

　　［abstract］ objective:to construct recombinant adenovirus expressing epsteinbarr virus(ebv)lmp2 in vector ad5f35.methods:restriction fragment of lmp2 from pshlmp2 was inserted in the vector of pdc316. the insertion and the direction of the insert were confirmed by polymerase chain reaction(pcr) and restriction enzyme digestion. the constructed pdc316lmp2 was cotransfected with adenovirus backbone pbhgfiber5/35 into 293 cells to establish the recombinant adenovirus ad5f35lmp2, which was confirmed by pcr and indirect immunefluorescence test.results:the construction of pdc316lmp2 was completed and confirmed with pcr and restriction enzyme digestion. second, the significant virus plaques was observed in the 293 cells cotransfected with pdc316lmp2 together with pbhgfiber5/35, which means the successful homologue recombination and virus packaging of the interest fragment in 293 cells. third, the successful construction of the recombinant adenovirus ad5f35lmp2 with pcr was confirmed, and the efficient expression of lmp2 protein was observed on the cell membrane with indirect immunefluorescence test.conclusion:the recombinant adenovirus of ad5f35lmp2 which contains the fulllength coding region of ebv lmp2 protein has been established that could be used in the gene therapy for nasopharyngeal carcinoma patients and to test the biosafety and biological function of ad5f35lmp2 in the future.

　　［key words］ nasopharyngeal carcinoma；recombinant adenovirus；gene immunotherapy

　　鼻咽癌（npc）是中国南方常见的恶性肿瘤之一。WWW.133229.COMnpc患者主要靠放射治疗。但放疗对机体的非特异性损伤较大，治疗后完全缓解的患者约有40%～50%出现远处转移和局部复发而导致治疗失败。因此在常规治疗的基础上迫切需要寻找新的综合治疗手段，提高患者细胞免疫功能将成为肿瘤综合治疗不可缺少的一部分。研究表明在npc组织有eb病毒lmp2蛋白持续表达，lmp2蛋白具有ctl特异靶抗原的抗原决定簇，能促发特异性细胞免疫。dc是扩增特异性抗肿瘤ctl最好的抗原递呈细胞，目前重组腺病毒是将外源基因导入dc等细胞内常用的载体之一，本研究构建了含eb病毒lmp2全序列的ad5f35lmp2重组腺病毒，并对其在细胞内的表达进行了研究，为下一步进行该重组腺病毒的生物学功能研究及今后临床基因治疗应用奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 pshlmp2质粒含lmp2全cdna序列，由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤病毒室保存；admax腺病毒载体系统的穿梭质粒pdc316和骨架质粒pbhgfiber5/35购自microbix biosystems公司；大肠杆菌dh5α、293细胞为本室保存；质粒大量提取试剂盒qiagen plasmid midi kits购自德国qiagen公司；常用限制性内切酶、t4dna ligase、rtaq酶、核酸凝胶纯化试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；脂质体转染试剂lipofectamine 2000、optimem试剂购自美国invitrogen公司；lmp2特异性大鼠单抗为英国伯明翰大学rickinson教授馈赠；其它分析纯试剂由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 pshlmp2和pdc316质粒的扩增、提取、鉴定以及浓度和纯度测定 pshlmp2和pdc316质粒均为amp抗性，转化dh5α后，铺板、挑克隆、摇菌、提取质粒，以ecor ⅰ单酶切鉴定pshlmp2和pdc316。对pshlmp2和pdc316质粒用紫外分光光度计测定od值，判定其浓度和纯度。

　　1.2.2 重组真核表达穿梭质粒pdc316lmp2的构建 ecor ⅰ单酶切pshlmp2质粒，切胶回收1.9 kb左右大小的目的基因片段。ecor ⅰ单酶切pdc316，回收3.9 kb左右大小的载体片段，去磷酸化，酚氯仿回收。

　　线性化的pdc316空载体和lmp2 cdna目的片段的连接反应体系如下：lmp2 cdna目的片段9 μl，pdc316空载体1 μl，solutioni(连接反应液)10 μl，共20 μl，充分混匀，16℃水浴中连接过夜。第2天加入已在冰上溶解的100 μl dh5α感受态细菌中。置于冰上30分钟。42℃水浴中热激90秒，再迅速置于冰上2分钟。加入800 μl lb培养基中，37℃温和震荡(200 r/min)培养45分钟。3 000 r/min离心5分钟后，弃去上清700 μl。将剩余培养基200 μl混匀后涂于amp的lb琼脂板上，于37℃温箱中倒置培养过夜。

　　1.2.3 pdc316lmp2质粒克隆的挑取、摇菌扩增、pcr鉴定 pcr反应体系为去离子ddh2o 16.2 μl，pcr buffer 2.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，dntp 4.0 μl，taq酶0.3 μl，pdc316lmp2 dna模板1 μl，共25 μl。ddh2o替代dna模板作为阴性对照。pcr上游引物为5′tgaattcgcctcagttagtaccgt3′，下游引物5′actcgaggcagaacaaattgggtat3′。pcr反应条件为94℃预变性5分钟；94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共30个循环，72℃ 7分钟。模板扩增的片段长度800 bp。将pcr反应产物以琼脂糖凝胶方法进行电泳。

　　1.2.4 pdc316lmp2的酶切鉴定 smal ⅰ和sal ⅰ单酶切鉴定pdc316lmp2。质粒鉴定插入片段是否正向插入，然后挑取鉴定阳性、插入目的基因片段方向正确的克隆进行扩增、大量提取质粒并用紫外分光光度计测定od值，判定其浓度和纯度。

　　1.2.5 pdc316lmp2与腺病毒骨架共转染293细胞 按lipofectamine 2000操作手册将大量提取的质粒pdc316lmp2与腺病毒骨架质粒pbhgfiber5/35共转染hek293细胞。待细胞病变脱落后，收集细胞，经液氮反复冻融3次后，离心去除细胞碎片，0.2 nn滤膜过滤，-70℃保存备用。

　　1.2.6 ad5f35lmp2重组腺病毒纯化及pcr鉴定 将病毒用moi检测粗略估计上清中病毒颗粒的数量，以不同的moi再感染293细胞，低熔点琼脂铺板，待出现空斑后，挑取单个克隆的病毒再分别感染293细胞，待细胞全部病变脱落后，对产生的病毒上清进行pcr鉴定(病毒上清中加入蛋白酶k至终浓度100 μg/ml，55℃消化1小时，煮沸5分钟后作为模板，上游5′gctgcaggaaacaactcccaatatcca3′；下游5′aactggagggcagcatctaatgacc3′，野生型腺病毒ad5作阴性对照，其余条件同pdc316lmp2的pcr鉴定，扩增的片段长度1 300 bp)，挑取pcr鉴定正确的病毒株扩增进行后续实验。

　　1.2.7 ad5f35lmp2重组腺病毒rtpcr鉴定 trizol一步法分别提取正常293细胞和感染了ad5f35lmp2的293细胞的rna，进行rtpcr鉴定。rtpcr反应参数如下：逆转录体系为25 μl。2 μl细胞rna，1 μl oligo(dt)18(0.1 μg)，10 μl去离子水，75℃变性5分钟，自然冷却。加入5 μl 5×amv缓冲液，1 μl rnasin，2 μl amv(5 u/μl)，4 μl 2.5 mmol/l dntp，42℃作用1小时。75℃变性5分钟灭活逆转录酶，以合成的cdna为模板，进行pcr反应（上游5′cttctactcttggcagcagt3′，下游5′cgccatctccttctgtacgc3′，其余条件同ad5f35lmp2重组腺病毒的pcr鉴定，扩增的片段长度239 bp）。取5 μl rtpcr反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

　　1.2.8 重组非复制型腺病毒的鉴定 第5代重组腺病毒ad5f35lmp2病毒上清进行有复制能力的腺病毒（replicating competent adenovirus,rca）pcr鉴定（上游5′cctgcgagtgtggcggtaaa3′，下游5′cacaagggcgtctccaagtt3′, 野生型腺病毒ad5作阳性对照，其余条件同pdc316lmp2的pcr鉴定，扩增片段大小为1 201 bp）。同时用上述上清液感染293细胞及hela细胞，观察7天后hela细胞如无明显病变现象，再传代观察7天。

　　1.2.9 间接免疫荧光鉴定 收集ad5f35lmp2重组腺病毒感染的293细胞，用pbs洗涤2次，将合适浓度的细胞涂于细胞片上，丙酮固定，细胞孔用lmp2单抗覆盖，4℃孵育过夜，pbs洗，再分别覆盖荧光标记的羊抗大鼠igg，37℃孵育60分钟，pbs洗，伊文氏蓝复染，甘油封片，显微镜下观察照相。

　　1.2.10 重组腺病毒滴度的测定 采用tcid50法测定重组腺病毒滴度。方法如下：293细胞按1×104/孔接种于96孔板中，接种24小时后将系列稀释的病毒液加入孔中，每个稀释度接种10孔，设置2孔为阴性对照。37℃、5%co2细胞培养箱培养10天，观察每个稀释度细胞病变效应（cpe）出现的百分率，按照admax操作手册中的公式：t=101+d(s-0.5)计算病毒的滴度（d为稀释度的对数值，s为病变比例的和），计算出重组腺病毒的滴度。

　　2 结果

　　2.1 ad5f35lmp2重组腺病毒的构建 ad5f35lmp2重组腺病毒的构建流程图见图1。重组真核表达穿梭质粒pdc316lmp2的pcr鉴定见图2，扩增出800 bp条带的克隆为阳性克隆。pdc316lmp2的酶切鉴定见图3，smal ⅰ单酶切pdc316lmp2正向插入无串联的重组体产生的片段大小为一条约100 bp左右的条带及另一条约为5.7 kb条带；sal ⅰ单酶切pdc316lmp2见一条约1.2 kb左右的条带及另一条约为4.6 kb条带。结果显示大小、方向与预计值一致，进一步证实了重组载体构建的成功。将质粒pdc316lmp2与腺病毒骨架质粒pbhgfiber5/35共转染hek293细胞，7～10天后，细胞出现肿胀、圆缩等典型细胞病变（cpe），见图4。

　　2.2 ad5f35lmp2重组腺病毒纯化及pcr鉴定 adlmp2腺病毒单斑挑选pcr扩增结果见图5。pcr电泳可见各单斑在1 300 bp处均有高度特异性条带（泳道1～9），而野生型腺病毒的dna进行pcr时不出现此条带（泳道10）。

　　2.3 ad5f35lmp2重组腺病毒rtpcr鉴定 结果见图6。pcr电泳可见在239 bp处有高度特异性条带（泳道1），而野生型腺病毒不出现此条带（泳道3）。

　　图1 ad5f35lmp2重组腺病毒的构建流程图（略）

　　fig.1 construction of ad5f35lmp2 recombinant adenovirus

　　图2 pdc316lmp2的pcr鉴定（略）

　　fig.2 pdc316lmp2 plasmid identified by pcr

　　note:m.dl2000 marker；1.negative control；2.pdc316lmp2；3.dl15000 marker.

　　图3 pdc316lmp2的smal ⅰ和sal ⅰ酶切鉴定（略）

　　fig.3 identification of pdc316lmp2 plasmid by restriction enzyme digestion

　　note:1.pdc316lmp2 digested with smal ⅰ；2.pdc316lmp2 digested with sal ⅰ；m.marker dl15000.

　　图4 ad5f35lmp2重组腺病毒感染293细胞形态改变(×200)（略）

　　fig.4 the cytopathic effect of 293 cells infected with ad5f35lmp2(×200)

　　note:a.normal 293 cells；b.293 cells infected with ad5f35lmp2.

　　图5 单斑挑选pcr扩增结果（略）

　　fig.5 the first plaque selection by pcr

　　note:19.19 plaques;10.negative control;11.positive control;12.dl2000 marker.

　　图6 rtpcr检测ad5f35lmp2重组腺病毒中lmp2基因的转录（略）

　　fig.6 rtpcr detection of lmp2 gene transcription in recombinant adenovirus

　　note:1.rtpcr products of rna extracted ad5f35lmp2 infected 293 cells;2.positive control;3.negative control;4.dl2000 marker.

　　2.4 重组非复制型腺病毒的鉴定

　　2.4.1 pcr鉴定有复制能力的腺病毒（rca）见图7，结果可见pcr电泳野生型病毒的dna在1 201 bp处有高度特异性条带（泳道10），而各样品（泳道1～9）均不出现此条带，初步判断构建的腺病毒为重组复制缺陷型腺病毒。

　　图7 rca的pcr鉴定（略）

　　fig.7 identifieatin rca by pcr

　　note:19.19 samples;10.positive control;11,12.negative control;m.dl2000 marker.

　　图8 间接免疫荧光法检测lmp2重组腺病毒感染293细胞中lmp2的表达(×100)（略）

　　fig.8 the detection of lmp2 expression in 293 cells infected with ad5f35lmp2 by immunofluorescence(×100)

　　note:a.293 cells infected with ad5f35lmp2；b.normal 293 cells.

　　2.4.2 用病毒上清液感染293细胞及hela细胞，293细胞受病毒感染出现细胞皱缩、变圆、脱落和死亡等典型细胞病变（cpe），而hela细胞无明显病毒复制导致的cep现象，进一步判断为重组复制缺陷型腺病毒株。

　　2.5 重组腺病毒表达lmp2的免疫荧光鉴定 重组腺病毒ad5f35lmp2感染293细胞72小时后，用lmp2单抗进行间接免疫荧光检测的结果。可见在病毒感染的细胞涂片中，细胞呈现绿色荧光，表明lmp2在293细胞中得到有效表达，而正常的293细胞涂片结果为阴性，见图8。

　　2.6 重组腺病毒滴度的测定 用tcid50法测定病毒滴度，第5代重组腺病毒ad5f35lmp2的滴度为2×109 tcid50/ml。

　　3 讨论

　　研究表明eb病毒lmp1、lmp2蛋白具有ctl特异靶抗原的抗原决定簇，能促发特异性细胞免疫［1，2］。lmp1在病毒株间存在异质性，而lmp2持续表达在肿瘤细胞上，它的抗原决定簇在不同病毒株一致且存在于肿瘤病理切片样本中［3］。因此，目前国内外治疗eb病毒相关的恶性疾病多利用lmp2抗原决定簇。效应ctl细胞的功能为裂解靶细胞，中国医学科学院曾毅等人研究了npc外周血淋巴细胞ctl介导的细胞免疫反应及其hla的限制现象，发现npc的特异性t淋巴细胞对npc的癌细胞有一定的特异性杀伤作用。国内外有少量报道npc病人、ebviga/vca阳性的人较正常人对eb病毒特异性细胞免疫功能呈不同程度降低，提示了ebv特异性细胞免疫力低可能与npc发生有关［46］。目前应用eb病毒多克隆ctl治疗和预防eb病毒引起的淋巴细胞增生性疾病已经取得了成功。1996年美国rooney首次成功地用异体hla匹配的ctl治疗ebv引起的b淋巴细胞增生症，临床效果十分显著。sing等［7］分离出针对lmp2的特异性ctl，它们能特异性杀伤eb病毒阳性的hodgkin’s病人的rs细胞，并使病人的病情得到5～8个月的稳定。savoldo等［8］用特异性ctl治疗慢性活动性eb病毒感染综合征，5例患者中4例临床症状消失，疗效显著。straathof等［9］用自体ctl治疗npc患者也有令人鼓舞的结果，治疗的10例患者6例缓解，1例部分缓解，1例病情维持稳定。

　　dc是体外扩增特异性抗肿瘤ctl的最好的抗原递呈细胞，目前最常用腺病毒载体为ad5型腺病毒（c组腺病毒），但dc细胞缺乏与血清型c组腺病毒高亲和力的car表达，因此除非用高滴度的病毒感染，否则效率不高［10］。b型腺病毒（ad35）的纤维蛋白可与普遍存在于细胞（如dc细胞）表面的受体膜蛋白cd46结合，不依靠car受体存在而感染相应靶细胞，此外，人类自然感染ad35的个体是非常罕见的，用ad5f35载体可减少被前期存在的中和抗体清除的影响。因此，人们考虑用ad35纤维修饰ad5改善转导效率及靶向，rea等［11］报道用ad35纤维基因相应部分取代ad5载体全部纤维基因或部分纤维基因，成功构建了ad5f35腺病毒载体。且用ad5f35感染dc细胞明显比用ad5或ad5经过其它b组腺病毒修饰纤维突和茎者的腺病毒更有效，提示提高载体感染细胞能力将在降低治疗或预防用载体量方面有意义，便于临床应用及降低毒性［11，12］。本研究构建了含eb病毒lmp2全序列的ad5f35lmp2重组腺病毒，经挑斑纯化并对其在细胞内目的基因及其蛋白表达进行了研究，结果显示ad5f35lmp2重组腺病毒能有效表达目的基因lmp2蛋白，为下一步进行该重组病毒的生物学功能研究及今后开展临床基因免疫治疗应用奠定了基础。

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