【摘要】 目的：探讨中药芪苈强心对急性心肌梗死(acute myocardial infarction, ami)大鼠心功能和炎症细胞因子tnfα、il10表达的效用。方法：结扎大鼠左前降支，建立ami模型。存活者随机分为梗死组（mi组）和芪苈强心治疗组（miq组），另设假手术组（s组）。miq组术后次日给予芪苈强心生药按4 g/(kg·d)溶于生理盐水1.5 ml治疗，mi组和s组仅以等量生理盐水同时间点灌胃，分别于术后第1、4周采用超声心动图和血流动力学检测心功能，实时定量pcr和免疫组织化学染色检测心肌组织中tnfα和il10表达。结果：mi组大鼠左室功能明显减低，心肌细胞分泌的炎症因子tnfα/il10比值明显升高。给予芪苈强心治疗后，心肌梗死大鼠心功能明显改善，心肌细胞表达tnfα显著减少，il10表达显著增加。结论：减少心肌细胞促炎因子和增加抗炎因子的免疫调节作用可能是中药芪苈强心改善ami大鼠心功能的免疫药理机制之一。
【关键词】 芪苈强心 急性心肌梗死 tnfα il10
qiliqiangxin regulates tnfα and il10 expression in cardiac myocytes of the rats with acute myocardial infarction
song you,li ya,cheng xiang,yao rui,wang man,liao yuhua.
institute of cardiology, union hospital, tongji medical college, huazhong university of science & technology, wuhan 430022,china
［abstract］objective:the study is designed to explore the effects of traditional drug qiliqiangxin on heart function and expression of proinflammatory cytokine tumor necrosis factorα and antiinflammatory cytokine interleukin10 in rats with acute myocardial infarction (ami).methods:rats with ami were induced by left anterior descending branch ligation,and then were randomly divided into drugtreated group (miq) and infarcted group (mi) compared with shamoperated group(s). rats in miq group were treated with crude drug of qiliqiangxin of 4g/（kg·d）dissolved in 1.5ml normal saline at next day after operation, while in the mi group and s group,the rats were treated with normal saline at the same time. heart function of rats were detected at the end of 1st week and 4th week with echocardiogram and hemodynamics.myocardial cytokines including the proinflammatory cytokine tumor necrosis factor (tnf)α and the antiinflammatory cytokine: interleukin (il)10 were analyzed with realtime polymerase chain reaction (pcr)and immunohistochemical staining.results:in ami, the left ventricular function decreased, and the ratio of tnfα/il10 in myocardium increased obviously.the cytokines were principally secreted by cardiac myocytes. the therapy of qiliqiangxin markedly improved left heart function, reduced the production of tnfα and increased il10 levels in cardiac myocytes.conclusions:the immune regulatory effects of qiliqiangxin concerns with attenuated production of proinflammatory cytokine and raised expression of antiinflammatory cytokine,which should be one of the pharmacological mechanism of qiliqiangxin to improve heart function of rats with ami.
［key words］ qiliqiangxin;acute myocardial infarction;tnfα;il10
急性心肌梗死（acute myocardial infarction, ami）后心肌细胞产生一系列细胞因子，如tnfα、il10等[1]。WWw.133229.CoMtnfα具有促炎作用，il10具有抗炎作用，这两类作用相反的因子在心肌中表达水平可能与ami后心室重塑以及心力衰竭相关。中药芪苈强心已被临床证实可以改善心力衰竭患者的心功能，但其具体作用机制尚未明了。本实验旨在通过对大鼠ami模型进行干预，研究芪苈强心对ami后炎症因子的影响，探讨该药治疗ami后心衰的部分药理机制。
1 材料与方法
1.1 建模分组
健康、雄性sd大鼠，体重180～250 g，来自华中科技大学同济医学院动物中心。盐酸戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔内注射麻醉。经口气管插管行小动物呼吸机辅助呼吸，潮气量2～3 ml，吸呼比1：2，呼吸频率60次/分。经左前胸廓旁第3、4肋间开胸，暴露心脏，剪开心包，在肺动脉圆锥和左心耳交界处用3～0号丝线结扎左前降支（lad）近端制成心肌梗死模型，缝合心腔。术后存活者随机分为芪苈强心药粉（河北以岭医药集团赠送）治疗组（miq）及梗死组（mi），进一步分为一周治疗亚组（miq1）、一周梗死亚组（mi1）、四周治疗亚组（miq4）及四周梗死亚组（mi4），每组各15只。另以心脏相同部位穿线但不结扎前降支的同种大鼠作为假手术(s)组、一周亚组（s1）及四周亚组（s4）各12只。
1.2 给药方法
miq组按照芪苈强心在临床患者用量的50倍，即4 g/（kg·d）溶于生理盐水总量约1.5 ml，于术后次日灌胃给药，mi组和s组大鼠在相同时间点给予等量生理盐水灌胃。
1.3 心脏超声评价心功能
使用ge vivid7 超声仪，探头频率10 mhz。将大鼠麻醉后仰卧固定，获取胸骨旁左室长轴和乳头肌水平短轴切面。检测指标包括左室舒张末期内径（lvedd）、射血分数（ef）和短轴缩短率（fs）。
1.4 血流动力学测定
大鼠麻醉后，剪开颈部皮肤，分离出右侧颈动脉，结扎远心端，用动脉夹夹住近心端。动脉穿刺插入1 mm聚乙烯导管，松开动脉夹，将导管缓慢插入左心室。通过同步描记电生理记录仪上的压力换能器测定心率（hr）、左室收缩末压力（lvsp）、左室舒张末压力（lvedp），并计算左室压力最大升降速率（±dp/dt）。
1.5 心肌组织标本留取
以超声心动图观察到室壁活动局限性减弱或形成室壁瘤、左室射血功能明显减低作为心肌梗死标准，经导管注入10％氯化钾2～3 ml，使心脏停搏于舒张期,开胸切取心脏，于左室长轴中点处垂直于长轴将心脏分为心尖半和心底半。
1.6 组织病理
将待检心底半心肌标本用10％中性缓冲甲醛液固定18小时后脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。连续切片3 μm厚，经he染色后封片镜检。每张切片于高倍镜下分别在梗死区和非梗死区随机取5个视野计数淋巴细胞，以均数/高倍镜作为该切片的淋巴细胞浸润数。
1.7 免疫组化检测心肌组织细胞因子表达
取石蜡包块连续切片3 μm厚，捞片于多聚赖氨酸防脱处理过的载玻片上。切片脱蜡至水。3％h2o2室温10分钟灭活内源性过氧化物酶。冲洗后pbs浸泡5分钟。95℃微波10分钟修复抗原活性。5％正常血清封闭，分别滴加1:200稀释抗大鼠il10和tnfα抗体，4℃孵育过夜。ph 7.4磷酸盐缓冲液（pbs）冲洗5分钟，3次。滴加生物素化相应二抗，37℃孵育20分钟。pbs冲洗5分钟，3次。滴加链霉亲合素－生物素－过氧化物酶复合物－辣根过氧化物酶（sabchrp），37℃孵育20分钟。pbs冲洗5分钟，3次。二氨基联苯胺（dab）室温下显色至满意，自来水终止反应。苏木素复染细胞核30秒，洗去多余染液，酒精梯度脱水后封片，显微镜下观察。在多功能真彩色病理图像分析系统的10×40倍光镜下，每张切片选5个视域，实验组3人采用双盲法测量各细胞因子在各切片中表达的单位面积积分光密度（iod/area），取平均值进行半定量分析。
1.8 实时定量rtpcr检测细胞因子表达
分别取心尖半标本梗死区周边心肌各100 mg剪碎，应用trizol 1000 μl匀浆、抽提组织总rna。应用rtpcr法逆转录至cdna，所有引物均参照genbank提供的序列，用primer5.0合成，由上海生物工程公司合成。引物设计如下：tnfα(465bp)：上游：5’ctg ggc agc gtt tat tct3’，下游：5’ttg ctt ctt ccc tgt tcc3’，退火温度54℃；il_10(273bp)：上游：5’agt cag cca gac cca cat3’，下游：5’ggc aac cca agt aac cct3’，退火温度56℃；gapdh(210bp)：上游：5’gat ggt gaa ggt cgg tgt g3’，下游：5’gag gtc aat gaa ggg gtc g3’，退火温度60℃。反应条件：应用sybr greenⅰ荧光染料技术行实时定量pcr反应，按照下列程序：第一次循环94℃2分钟，其后以94℃变性45秒；56℃退火40秒，72℃延伸60秒，循环45周期，最后72℃5分钟终止。以阴性对照gapdh作参考，计算机分析ct值，即每个反应管内荧光强度达到系统认为的有目的dna合成时的循环数，用以评定各因子mrna的实时定量表达水平。
1.9 统计学处理
计量数据以±s表示，采用spss 10.0软件用t检验、方差分析和直线相关分析等处理。
2 结 果
2.1 芪苈强心药物对ami大鼠心功能的影响
与s组相比，超声心动图显示 mi组大鼠左心室扩大，室壁活动局限性障碍，收缩功能降低；miq组部分减少左心室扩张并提高射血分数。血流动力学结果也显示：药物治疗后左室压力最大升降速率（±dp/dt）较mi组明显增强，见表1、图1。两种方法检测结果均显示，用芪苈强心药物治疗4周比用药1周的心功能改善效果更显著。表1 ami大鼠1周、4周末治疗前后超声、血流动力学改变（略）
2.2 芪苈强心药物对ami大鼠心脏淋巴细胞和心肌细胞因子表达的影响
he染色光镜下计数心肌组织淋巴细胞，见s组大鼠心肌细胞排列整齐，无心肌细胞坏死和纤维组织增生，心肌组织未见明显淋巴细胞浸润；而mi组心肌细胞坏死，纤维组织增生，梗死区和非梗死区均可见大量淋巴细胞浸润；芪苈强心药物治疗对mi后浸润心肌组织的淋巴细胞数无明显影响，见图2上。免疫组化染色显示心肌组织细胞因子主要表达在梗死区存活的心肌细胞和非梗死区心肌细胞胞浆内，芪苈强心药物部分降低tnfα蛋白表达并增加il10蛋白表达，见图2下。与假手术组相比，mi组实时定量rtpcr检测心肌组织tnfα和il10 mrna表达增加，tnfα表达水平4周时较1周时升高，il10表达4周时稍低于1周，tnfα/il10比值明显升高。miq组芪苈强心药物治疗后心肌组织tnfα表达降低，il10表达增加，tnfα/ il10比值下降，见表2。表2 ami大鼠1周、4周末治疗前后细胞因子mrna表达改变（略）
2.3 心肌组织tnfα/il10 mrna比值与左心室射血分数（ef）的相关性分析
mi4组和miq4组心肌组织tnfα/il10比值与ef值呈负相关（mi4组：r=-0.730，p<0.05；miq4组：r=－0.721，p<0.05）
3 讨 论
芪苈强心胶囊是新研发治疗心力衰竭的中成药，其有效成分主要包括黄芪、附子、丹参及苈葶子等祖国传统中药材。经过3期临床试验证实芪苈强心胶囊具有强心、利尿、扩血管作用，治疗轻、中度充血性心力衰竭安全有效。本研究发现，大鼠ami后给予芪苈强心治疗后，心功能比单纯心肌梗死组有所好转，左室射血分数上升，心肌收缩能力部分增强，尤其在持续给药4周后心功能改善效果更明显，相关性分析结果表明，心功能的改善可能与药物调节心肌细胞分泌的tnfα/il10比例改变有关。
近年来研究发现，免疫炎性反应参与ami后心室重塑，是ami后加重心脏损害的重要机制，不同的细胞因子表达水平在此过程的发展和转归中发挥不同功效[2]。tnfα是一种促炎细胞因子，在ami的发展中起加速心肌坏死、恶化心功能的作用。在前期研究中发现，ami后大鼠心脏tnfα表达较假手术组显著升高[3]。临床实验证实，tnfα与心衰严重度及心脏舒缩功能下降正相关[4]。在用β受体阻滞剂治疗ami大鼠的研究中也发现tnfα下降与心功能好转明显正相关[5]。il10主要抑制th细胞产生的ifnγ及tnfα，进而抑制中性粒细胞等炎性细胞的浸润、游走、增殖及活化，在免疫反应中起抗炎作用。国外学者研究发现在缺血性心肌病的心肌局部有il10的产生[6]。aukrust等对慢性心衰的患者观察发现，抗炎因子il10与促炎因子tnfα水平皆升高，但il10没有上升到tnfα相应水平[7]。国内学者则认为，急性心梗后抗炎因子il10前3天达峰，随后下降，与其他促炎因子上升比例失调，从而加重免疫介导的组织损伤[8]。由于细胞因子在心肌梗死后心衰的病理变化中发挥重要作用，靶向性抗炎症细胞因子治疗曾被寄予厚望，但是大规模临床试验的结果却未能证实，因此目前主张针对心肌细胞进行靶向性免疫调节治疗[9,10]。
本研究采用芪苈强心治疗ami大鼠，结果发现：心肌梗死区浸润的淋巴细胞计数在治疗组与梗死组无显著差异，即全身炎症反应招募的免疫反应无明显差别；而心肌梗死后健存心肌细胞表达的细胞因子治疗组与梗死组存在显著差异。心肌梗死后心肌细胞表达tnfα、il10等细胞因子，说明心肌细胞在病理状态下具有炎症因子自分泌作用，这些细胞因子参与ami后炎症反应，当促炎因子高于抗炎因子时，可导致心肌坏死后心室重塑，心功能下降。心肌梗死大鼠给予芪苈强心药物治疗，尤其是在持续用药4周后，心肌细胞促炎因子tnfα表达水平降低，抗炎因子il10表达水平升高，tnfα/ il10比值显著降低，同时监测这组大鼠心功能参数如左室舒张末期内径、射血分数、短轴缩短率和左室压力最大升降速率等皆明显改善。
我们的实验结果显示芪苈强心药物减少心肌细胞促炎因子tnfα和增加抗炎因子il10的免疫调节作用，可能是中药芪苈强心部分改善心肌梗死大鼠心功能的免疫药理机制之一。
【参考文献】
1 liao y h, cheng x. autoimmunity in myocardial infarction\[j\]. int j cardiol, 2006;112(1):2126.
2 廖玉华,陶 荣,程 翔 et al.急性心肌梗塞后心肌炎症反应及其意义\[j\]. 中国分子心脏病杂志,2002;2(3):79.
3 刘 英,廖玉华,程 翔 et al.大鼠心肌梗塞后心肌炎症反应和细胞因子表达\[j\].中国免疫学杂志,2004; 20(12): 858861.
4 torreamione g, kapadia s, lee j et al. tumor necrosis factorα and tumor necrosis factor receptors in the failing human heart\[j\].circulation,1996;93:704711.
5 程 翔,廖玉华,李 彬 et al.早期美托洛尔治疗对急性心肌梗死大鼠心肌炎症因子表达和心功能的影响\[j\].中华心血管病杂志, 2005;33(5):448452.
6 francis s e, holden h, holt c m et al. biosynthesis and maturation of the malaria aspartic hemoglobinases plasmepsins i and ii \[j\]. j biol chem, 1997;272(23):1496114968.
7 aukrust p, muller f, ueland t et al. enhanced levels of soluble and membranebound cd40 ligand in patients with unstable angina. possible reflection of t lymphocyte and platelet involvement in the pathogenesis of acute coronary syndromes\[j\]. circulation, 1999;100(6):614620.
8 邓 蔚,姜德谦.急性冠状动脉事件患者血清白细胞介素10和白细胞介素12水平测定及临床意义\[j\].中国循环杂志，2000;15(4):236.
9 mann d l, mcmurray j j, packer m et al. targeted anticytokine therapy in patients with chronic heart failure: results of the randomized etanercept worldwide evaluation (renewal)\[j\]. circulation,2004;109:15941602.
10 廖玉华,程 翔.抗细胞因子治疗靶向心肌细胞?［j］.临床心血管病杂志，2005;21(6):321322.
