【摘要】 目的：探讨角膜上皮细胞刺激淋巴细胞增生的能力和共同刺激通路分子在角膜上皮细胞的表达。方法：体外共同培养人角膜上皮细胞和外周血单个核细胞，免疫组织化学染色方法测定hla ⅱ类抗原、cd40、cd154、cd80和cd86的表达，同时对比角膜移植排斥反应的移植片。荧光辅助细胞筛选、分析、测定cd69的上调。结果：hla ⅱ类抗原在角膜上皮细胞表达，γ干扰素能够升高共同刺激通路分子cd40和cd80的表达；而且hla ⅱ类抗原和cd40均在角膜移植排斥反应的移植片上被检测出。t淋巴细胞在共同培养系统中被上皮细胞激活。结论：人角膜上皮细胞参与角膜移植排斥反应过程，移植免疫排斥反应被上皮细胞所诱导和初始化，但最终反应作用于内皮细胞。
【关键词】 抗原递呈细胞 角膜上皮细胞 外周血单个核细胞 共同刺激通路
the immunological character of corneal epithelial cells
wang fan.
university eye hospital hamburgeppendorf,university of hamburg,hamburg 20246,germany
［abstract］objective:to investigate the capability of corneal cells to stimulate lymphocyte proliferation and the expression of costimulatory molecules on primary human corneal epithelial cells.methods:human corneal epithelial cells were cocultivated with peripheral blood mononuclear cells(pbmc). expression of hla class ⅱ antigens, cd40, cd154, cd80 and cd86 was measured by immunohistochemical staining,and the expression of such molecules above on rejected corneal grafts was contrastingly assessed. activation of lymphocytes was determined by measuring upregulation of cd69 by facs analysis.results:hlaⅱ expression was detectable on human primary corneal epithelial cells,and furthermore, upregualtion of costimulatory molecules cd40 and cd80 were also found after induction with γinterferon. both of hla and cd40 were expressed on rejected corneal grafts. t lymphocytes were activated by epithelial cells in the coculture system.conclusion:human corneal epithelial cells are involved in rejection process of the corneal transplantation. the immunological reaction is triggered by epithelial cells,and endothelial cells suffer as the targets.
［key words］antigen presenting cells(apc)；corneal epithelial cells；peripheral blood mononuclear cells(pbmc)；costimulatory pathway
预防和治疗同种移植排斥反应仍然是当今角膜移植术最具有挑战性的领域。WwW.133229.cOM几十年来利用动物模型研究已证实：角膜移植排斥反应像其他的器官移植一样，是个t淋巴细胞介导的免疫过程。同其他的移植组织一样，角膜移植排斥反应主要依赖于t细胞介导的同种异体反应［1］。人类白细胞抗原(hla)是免疫反应中第一信号的主要靶分子，特别是hla ⅱ类抗原在免疫细胞之间的反应中发挥着重要的调节作用［2］。有证据表明hla ⅱ类抗原仅限于角膜朗格罕氏细胞和血管内皮细胞。 但是，hla ⅱ类抗原也表达在同种移植排斥反应后的其他角膜细胞上［3］。除了t细胞活化，一个有效的免疫应答的发展也要求第二信号或共同刺激信号，对于t细胞的增生和细胞因子的分泌，它是非特异性的［4］。这个共同刺激信号是由b71(cd80)或b72(cd86)与t细胞表面它们的受体cd28和ctla4之间的反应所介导的。其他的t细胞表面分子，像cd154(cd40的受体)、cd2、lfa1和icam1构成了第二信号。角膜移植实验模型研究证明，阻断cd80/86cd28和ctla4ig之间的反应延迟了免疫反应，ctla4ig结合抗cd154抗体或者可的松治疗进一步推迟了鼠类角膜移植排斥反应的启动［5］。排斥反应的组织学研究表明，淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞已经被确认为优势的免疫细胞，导致了角膜组织细胞与浸润的淋巴细胞之间的免疫反应参与角膜移植排斥反应机制的假想［6］。但是，角膜细胞导致t淋巴细胞增生的过程尚未明了。本实验中，我们假设在角膜移植排斥反应过程中，角膜上皮细胞同样作为抗原递呈细胞参与了免疫反应。
1 材料与方法
1.1 角膜上皮细胞的培养
角膜上皮细胞来自内皮细胞数量不足、不适于角膜移植术的人供体角膜，或角膜移植术的角巩膜环。细胞培养于0.5 ml的培养液ham’s f12/dmem(gibco invitrogen)，添加10%胎牛血清fcs(gibco invitrogen)，10 ng/ml鼠上皮生长因子(biochrom)，5 μg/ml牛胰岛素(sigma)，0.1 μg/ml霍乱毒素(sigma)，5 mg/l转铁蛋白(sigma)，0.18 mmol/l腺嘌呤(sigma)，0.4 mg/l水合可的松(sigma)，2 nmol/l三碘甲状腺氨酸(sigma)，4 mmol/l谷氨酸(biochrom)和抗生素［7，8］。每周更换2次培养液。
1.2 提取外周血单个核细胞（pbmc）
从健康志愿者采集大约15 ml的新鲜血液，10 ml的histopaque1077缓慢加入10 ml的新鲜血液表面，400 g离心5分钟。将离心后中间的透明相转入另一个干净的离心管，pbs冲洗，细胞悬液250 g离心10分钟。细胞沉淀再次溶解于rpmi1640培养液(gibco invitrogen)，添加2 mmol/l l谷氨酸，1 mmol/l hepes液(gibco)，10%胎牛血清(gibco invitrogen)和抗生素。每次提纯细胞，应用台盼兰染色排除试验测定细胞的完整性和细胞数量。
1.3 共同培养角膜细胞与外周血单个核细胞
2×104人角膜上皮细胞培养于8孔培养板，部分细胞加入1 000 u/ml γ干扰素。3天后，新鲜提纯的pbmc(1×106/孔)和抗cd28单克隆抗体(1 μg/ml)加于角膜上皮细胞培养板中，继续进行无γ干扰素的培养。pbmc与预先固定的抗cd3抗体（4 μg/ml）和抗cd28抗体(1 μg/ml)作为阳性对照，培养无任何添加物的pbmc作为阴性对照。所有共同培养物保持培养在rpmi1640添加10%胎牛血清培养液中，继续培养2天。共同培养系统中的细胞悬液收集后用于荧光辅助细胞筛选分析，用70%甘氨酸乙醇缓冲液固定附着于培养板表面的角膜细胞和pbmc，或者10%的福尔马林固定做免疫组织化学分析。
1.4 免疫组织化学染色
1.4.1 培养2×104人角膜上皮细胞，生长至细胞融合状态后固定于70%甘氨酸乙醇缓冲液或10%的福尔马林。细胞分别与抗hladp、dq、dr(dakocytomation)、cd40(acris)的单克隆抗体孵育。稀释抗体于1∶100室温下孵育30分钟。根据说明书操作步骤应用lsab2试剂盒(dakocytomation)检测已结合的抗体：孵育生物素结合的链接抗体10分钟，碱性磷酸酶标记的链霉抗生物素蛋白孵育10分钟，再伴随10分钟的底物色原溶液反应。苏木精对比染色，干燥后水溶性封片剂(merck)封片。相对染色强度分类为：-（阴性），+（弱阳性，<25%），（中度，25%～50%），（强,50%～75%），（极强，75%～100%）。
1.4.2 γ干扰素刺激的角膜细胞和pbmc共同培养系统实验也同法固定，分析cd80、cd86和cd154共同刺激分子通路表达。另外，检测共计15个来自穿通性角膜移植术患者的角膜植片。其中，10个角膜诊断为角膜内皮功能失代偿，5个角膜诊断为圆锥角膜。角膜植片固定于4%的福尔马林，石蜡包埋切片，检测hladp、dq、dr、cd40和cd154的表达。
1.5 荧光辅助细胞筛选分析（facs）
荧光辅助细胞筛选分析仪(bectondickinson facscalibur)进行双色分析。在pbmc与γ干扰素刺激的人角膜上皮细胞共同培养体系中，用抗cd3fitc（t淋巴细胞）和抗cd69pe单克隆抗体(活化的t淋巴细胞)来定量分析活化的t淋巴细胞的百分比。细胞分别和饱和浓度(1 μg/106 cells)的抗cd3fitc、抗cd69pe抗体以及阴性对照抗体在暗处4℃孵育30分钟。facs分析之前10分钟加propidium iodide(sigma)入样本，至最终浓度为1 mg/ml，根据前向角散射（forward scatter, fsc）的形态特征和propidium iodide的染色来分类淋巴细胞和单核细胞。应用cellquest软件(becton dickinson)进行数据分析。
2 结果
2.1 角膜排斥反应植片
圆锥角膜切片显示角膜各层无炎性细胞和hla ⅱ类分子，而排斥的角膜移植片展示强阳性的hla ⅱ类抗原表达。阳性细胞特别表达在角膜上皮的基底层，甚至在内皮层。在角膜实质层，阳性细胞临近于新生血管区域，另外一些阳性细胞位于血管内皮，还有一些散布于实质层各处，见图1。在植片边缘增生和血管化的结膜组织上，也有强烈的hla ⅱ类抗原阳性细胞。10个排斥反应的植片中有5个显示cd40阳性细胞位于角膜上皮层的表层。角膜各层细胞未见cd154阳性细胞。所有的圆锥角膜均为cd40和cd154阴性。
2.2 角膜上皮细胞的hla、cd40、cd80和cd86表达
无γ干扰素刺激的超过50%的培养的人角膜上皮细胞呈现hla ⅱ类抗原阳性，γ干扰素诱导以后的细胞显示了明显的表达上调，几乎100%的角膜上皮细胞为阳性染色，在样本中，可观察到阳性细胞或在细胞表面或在细胞浆中，见图2。无γ干扰素刺激下，所有的角膜上皮细胞为cd40阳性，γ干扰素处理后进一步提高了阳性表达。无论γ干扰素诱导与否，超过50%的角膜上皮细胞显示cd80阳性，而cd86为阴性，见表1。表1 免疫组化分析hladp、dq、dr(人类白细胞抗原)、cd40、cd80和cd86在角膜上皮细胞的表达（略）
2.3 共同培养系统的cd80、cd86和cd154表达
cd80/cd86、cd40和它的受体cd154是hla信号系统之外的第二信号系统，是t细胞增生和细胞因子分泌所必需的条件。在共同培养系统中，cd80和cd86均可被观察到阳性表达，却无cd154阳性细胞，见表2。表2 角膜上皮细胞和pbmc共同培养体系中的cd80、cd86和cd154的表达（略）
2.4 荧光辅助细胞筛选分析（facs）
cd69作为活化的t淋巴细胞的标记物，在pbmc和角膜上皮细胞共同培养之后被测定。最高水平的应答反应在pbmc与γ干扰素预先诱导的角膜上皮细胞共同孵育系统中被检测到，见图3。
3 讨论
临床上，角膜移植的排斥反应多数被认定为角膜内皮功能的失代偿。在此研究中，我们探讨了角膜上皮细胞的培养以确定它们在体外作为潜在的抗原递呈细胞的分子表达和能力。至今，尚缺乏对这些细胞的功能和免疫学特性的定义。
第一信号：hla ⅱ类抗原。我们发现hla ⅱ类抗原表达在未受诱导的人角膜上皮细胞上，且能够被γ干扰素提高其表达。实验性鼠角膜移植模型显示可诱导新生血管化和淋巴排泄通道发展的外界刺激也可以提高淋巴细胞的活化［9］。本研究中，我们发现排斥反应的移植片增厚，同时有新生血管长入，并有hla ⅱ类抗原表达阳性的细胞浸润。免疫淋巴细胞可以沿着这些新形成的血管从淋巴结循环至角膜并破坏免疫赦免状态，从而导致移植失败，植片被排斥。
第二信号：共同刺激通路。cd154：cd40通路在细胞介导的免疫反应的生成中是重要的，并且被认为是t细胞活化过程中的关键通路［10］。cd40被发现是抗原递呈细胞和间叶细胞的变种，包括b淋巴细胞、树枝状细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞和上皮细胞［1114］。cd154是cd40的配体(cd40l)，是肿瘤坏死因子(tnf)家族成员。cd154和cd40结合诱导了信号通道的开启，从而导致cd80和cd86的表达升高［1517］。动物实验模型显示，阻断cd40：cd154通路足以诱导th1介导的接触性超敏反应耐受， 从而有效地延长植片的存活率［1822］。
两条证据强调了在移植排斥过程中，t细胞共同刺激通路中b7：cd28通路的任务。首先，体外药物阻断b7和cd28分子之间的反应，可诱导t细胞递呈同种抗原长时间持续的无反应性应答。其次，在血管化的器官移植后，b7分子可在24小时之内被诱导在血管内皮上，意味着t 细胞能够通过移植的器官本身接受共同刺激信号［23］。实验证明同种角膜移植术后结合抗cd80和抗cd86单克隆抗体治疗可有效地延长角膜移植片的存活［24］。这些结果说明了cd80和cd86共同刺激分子在角膜移植排斥反应中的重要作用。
角膜各层的排斥反应可各层独立发生，也可同时混合发生［25］。 通过共同培养研究得出结论，pbmc和角膜上皮细胞之间的接触可促进共同刺激分子在角膜细胞上的表达。荧光辅助细胞筛选分析和免疫组织化学染色显示人角膜上皮细胞刺激t淋巴细胞表达高水平的cd69。t细胞受体识别角膜上皮细胞上的hla/多肽复合体得到信号1，同时， 提供cd28抗体以结合角膜细胞上的cd80或cd86分子，得到信号2。信号1和信号2导致了t细胞活化和增生的阳性刺激。同理作用于cd40cd154第二通路。本研究阐述了角膜移植排斥反应的机理以及角膜上皮细胞作为潜在抗原递呈细胞的功能，供体角膜上皮细胞和受体t淋巴细胞的接触触发了移植片的同种免疫性反应，最终作用于角膜内皮细胞，导致内皮水肿，功能失代偿，移植失败。
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