【关键词】 缺血再灌注损伤;选择素;icam1;血液流变学; 阿加曲班
【摘要】 目的 探讨阿加曲班对大鼠肢体缺血再灌注损伤对血液流变学指标的影响，为缺血再灌注损伤的防治提供新思路。方法 采用大鼠肢体缺血再灌注模型，将14只wistar大鼠随机分为2组，对照组和阿加曲班组，每组7只。2组大鼠均于再灌注2 h后，酶联免疫吸附(elisa)法测定血浆p选择素、细胞间粘附分子1(icam1)浓度;取血检测血液流变学指标,包括血浆粘度(ηp)、全血低切还原粘度(lηre)、全血高切还原粘度(hηre)、红细胞压积(hct)、红细胞聚集指数(eai)、血沉方程k值(esrk)、红细胞刚性指数(tk)、红细胞变形指数(edi)。结果 大鼠肢体缺血再灌注2 h后，阿加曲班组血浆p选择素浓度、血浆icam1浓度显著低于对照组(p<0.01)。血液流变学指标与对照组比较，阿加曲班组ηp、hηre、lηre、eai和tk明显降低(p<0.05)，edi升高(p<0.05)，而对hct、esrk无显著影响(p<0.05)。结论 阿加曲班能够降低血浆p选择素和icam1浓度，进而改善大鼠肢体缺血再灌注损伤所造成的血液流变学异常。
【关键词】 缺血再灌注损伤;选择素;icam1;血液流变学; 阿加曲班
the effects of argatroban on hemorheological parameters in rats with limb ischemiareperfusion injury du liqing*,mi shijun,wang jinghua.*department of danger and severe medicine,the fengrun distriact people’s hospital,hebei,tangshan 064000,china
【abstract】 objective to investigate the effects of agatroban on hemorheological parameters,plasma pselectin and plasma icam1 of rats with limb ischemia/reperfusion injury in order to provide a new method for the prevention and therapy of ischemia/reperfusion injury. methods 14 wistar rats were randomly divided into control group and agatroban group, with 7 rats in each group.the rat model of limb ischemia/reperfusion injury was made according to the zhang lianyuan’s ways. the plasma pselectin and plasma icam1 levels were detected by enzyme linked immunosorbent assay (elisa) at 2h after reperfusion. the blood samples were taken and hemorheological indexes were detected, including plasma viscosity, low shear reduction viscosity, high shear reduction viscosity, hematocrit erythrocyte aggregation index, erythrocyte sedimentation rate k and erythrocyte rigidity index.results 2h after limb ischemia/reperfusionin rats,the plasma pselectin and plasma icam1 levels in argatroban group were significantly lower than those of control group(p<0.05).as compared with those in control group,the ηp、hηre、lηre、eai and tk in argatroban group were significantly decreased(p<0.05),however,edi was obviously increased(p<0.05),but no obvious effect on hct,esrk was observed.conclusion agatroban can reduce plasma pselectin and plasma icam1 levels,as a result,to improve hemorheological abnormality caused by limb ischemiareperfusion injury in rats.
【key words】 ischemiareperfusion injury; hemorheology; argatroban; pselectin; icam1
近年随着对缺血再灌注损伤基础研究的深入，对其再灌注损伤的保护研究也越来越多。wwW.133229.cOM试图应用不同的方法，通过不同的途径发挥作用。缺血预处理、抗氧化疗法、抗白细胞疗法等，都有很好的保护作用[1，2]。阿加曲班是化学合成的低分子药物,直接与凝血酶的催化活性位点结合,灭活凝血酶。近年研究表明阿加曲班还可抑制凝血酶的其他作用，如可以抑制肿瘤转移、炎性过程及血管成形术后的再狭窄等[3]，对微循环障碍和血液流变性也有一定影响[4]。但能否对肢体缺血再灌注损伤导致的血液流变学异常有良好的改善作用，我们对大鼠肢体缺血再灌注损伤进行了实验研究，观察对比阿加曲班干预和单纯缺血再灌注损伤导致的血液流变学异常有无显著性影响，为缺血再灌注损伤的临床防治提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性wistar大鼠14只，平均体重(25±20)g，购自郑州大学实验动物中心。自由饮水、进食，室温25.2 ℃，分笼饲养。
1.2 动物模型的制备 大鼠于术前12 h禁食，自由饮水。采用文献方法制作大鼠肢体缺血再灌注模型，沿大鼠双后肢根部用止血带结扎，完全阻断血流;阻断4 h后松解止血带，恢复双后肢血流。自大鼠腹主动脉放血处死动物，血液用做检测血液流变学指标及血浆p选择素和细胞间粘附分子1(intracellular adhension molecule1, icam1)浓度。
1.3 动物分组 实验大鼠14只，随机分为2组，阿加曲班组和对照组，每组7只。阿加曲班组缺血4 h，于再灌注前30 min给予阿加曲班5 mg/kg 腹腔注射。对照组大鼠单纯肢体缺血4 h后再灌注，再灌注前30 min给予等量0.9%氯化钠溶液，腹腔内注射。2组动物均于再灌注2 h后采血观察指标。
1.4 血液流变学指标测定 应用sa6000全自动血流变检测仪测定血浆粘度(ηp)、全血低切还原粘度(lηre,1/s)、全血高切还原粘度(hηre, 200/s)、红细胞比容(hct)、红细胞聚集指数(eai)、血沉方程k值(esrk)、红细胞刚性指数(tk)、红细胞变形指数(edi)。
1.5 elisa法测定血浆p选择素、icam1浓度 血标本均置于含抗凝剂edta的试管中，3 000 r/min离心15 min，-70℃冰箱内保存。样本统一测定，严格按照试剂盒说明操作。elisa试剂盒购自天津灏洋生物制品公司。
1.6 统计学分析 应用spss 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，p<0.05为差异无统计学意义。
2 结果
2.1 2组血液流变学指标比较 阿加曲班组ηp、hηre、lηre、eai和tk显著低于对照组(p<0.05)，edi高于对照组(p<0.05)，2组hct和esrk差异无统计学意义(p>0.05)。见表3。表3 2组血液流变学指标比较注：与对照组比较，*p<0.05
2.2 2组血浆p选择素浓度和icam1浓度比较 阿加曲班组血浆p选择素和icam1浓度低于对照组(p<0.05)。见表4。表4 2组血浆p选择素浓度和icam1浓度比较注：与对照组比较,*p<0.01
3 讨论
缺血再灌注损伤的发生机制错综复杂，活性氧代谢产物、钙超载、微循环障碍、血液流变性改变和凝血酶的激活等是导致该损伤的主要机制[5] 。在缺血再灌注时，机体的凝血活性增强主要是由于内皮细胞的直接损伤和各种细胞因子促进内皮细胞表达各种粘附分子，例如e选择素、p选择素和icam1[6];内皮损伤使内皮下的组织因子入血，另一方面，单核细胞和内皮细胞生成组织因子增加[7]。粘附分子和组织因子分别从内源性途径和外源性途径激活了凝血系统，其后果是使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，甚至导致微循环中广泛的微血栓形成。
微血栓的形成会增加血粘度，堵塞微血管，进一步加重微循环障碍和血液流变性异常。更重要的是，凝血过程会通过多种炎症发展，比如活化因子ⅹ(fⅹa)可以诱导内皮细胞表达细胞因子和粘附分子[8]。更能把凝血过程和炎症过程紧密地联系在一起的是凝血酶(因子ⅱa)，体外试验显示它能诱导单核细胞和中性粒细胞趋化[9]，诱导内皮细胞表达粘附分子，诱导中性粒细胞粘附[10]。凝血酶还能强力激活血小板，并促进血小板介导的中性粒细胞和内皮细胞之间的粘附[11]。体内体外试验均表明，fⅹa和凝血酶还能促进中性粒细胞和内皮细胞等细胞表达细胞因子[12]。
微循环障碍、血液流变性改变和凝血系统的激活，三者互为因果，相互影响，从而形成恶性循环，导致微循环缺血、瘀血、无复流，直接影响组织、器官的血液灌注和代谢，加重缺血再灌注损伤。
阿加曲班是化学合成的低分子药物,直接与凝血酶的催化活性位点结合,灭活凝血酶。由于阿加曲班分子量小,它能进入到血栓内部,直接灭活已经与纤维蛋白结合的凝血酶。其作用特点为: (1)直接灭活凝血酶(因子ⅱa)的活性[13],其作用不依赖于抗凝血酶; (2)不但灭活液相凝血酶,还能够灭活与纤维蛋白血栓结合了的凝血酶; (3)阻断凝血瀑布的正反馈,间接抑制凝血酶的产生; (4)治疗剂量下对血小板功能无影响,不导致血小板减少症;(5)具有良好的剂量-反应关系,效果和安全性可以预测;(6)与活化部分凝血活酶时间(aptt)或者活化凝血时间(act)相关性良好。阿加曲班可通过抑制凝血酶催化或介导的反应并且激活天然的抗凝剂蛋白c从而发挥其药理学作用[14]。阿加曲班在体外就能降低血粘度，并且呈现s曲线，有剂量依赖效应[15]。
本研究通过肢体缺血再灌注损伤的动物实验表明，阿加曲班可以有效改善肢体缺血再灌注后的血液流变学异常。分析原因主要有以下2点：(1)降低血浆p选择素和icam1浓度，减少白细胞粘附，从而减轻全身炎性反应。(2)直接灭活凝血酶(因子ⅱa)的活性，避免进一步促进凝血作用的级联反应,防止微血栓形成。综上所述阿加曲班表现出对缺血再灌注损伤的保护作用。
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