【关键词】 复方斑蝥注射液；免疫调节作用；dth；il2；tnfα
【摘要】 目的：研究复方斑蝥注射液（compound traditional chinese of cantharis injection，cci）对荷肝癌h22瘤小鼠免疫调节作用。方法：用2，4二硝基氯苯（2,4dinitrochlorobenzene，dncb）诱导荷肝癌h22小鼠皮肤迟发性超敏反应（delay type hypersensitivity，dth），观察cci对小鼠耳廓肿胀度、胸腺指数和脾脏指数的影响；用放免法检测该药对荷肝癌h22小鼠血清白介素2（interleukin2，il2）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，tnfα）水平的影响。结果：与空白对照组比，模型组小鼠耳廓肿胀度、胸腺指数和脾脏指数、il2和tnfα水平均明显降低，差异显著（p＜0.05）；与模型组比较，cci可使荷肝癌h22小鼠降低的耳廓肿胀度、胸腺指数和脾脏指数、il2和tnfα水平明显增高(p＜0.05）。结论：cci可提高荷肝癌h22小鼠免疫功能。
【关键词】 复方斑蝥注射液；免疫调节作用；dth；il2；tnfα
近年来，癌症发病率逐年增加，成为当前危害人类健康的重要疾病之一[1]。wwW.133229.coM复方斑蝥注射液商品名艾迪注射液[2]，是应用现代科学方法将方药中所含抗肿瘤及免疫活性物质提纯制成的静脉注射液[3]，经临床应用对消化道、呼吸道及生殖系统肿瘤有明显疗效[4]。本实验研究了cci对荷肝癌h22瘤小鼠的免疫调节作用，初步探讨了cci抗肿瘤作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物健康清洁级（spf）昆明小鼠120只，体重18g～22g，雌雄各半，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：scxk（黔）2002－0001。
1.2 实验药物、试剂及配制cci由贵州益佰制药股份有限公司生产，规格：每支10ml，每1ml相当于0.603g生药，批号：051215；5fu：上海旭东海普药业有限公司生产，批号：030405；丙酮：南京化学试剂厂生产，批号：20041103；dncb：北京市兴津化工厂生产，批号：20020402，临用前新鲜配制成5% dncb丙酮液和1% dncb丙酮液；tnfα放射免疫测定试剂盒和il2放射免疫测定试剂盒：天津九鼎医学生物工程有限公司生产。
1.3 主要仪器和器材电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司），tdl4zb离心机（湖南星科设备厂），125i放免测定仪（北京核仪器厂）。
1.4 肿瘤细胞株及其来源小鼠h22肉瘤由中科院上海细胞研究所提供。
1.5 实验方法
1.5.1 cci对荷肝癌h22小鼠耳廓肿胀度、胸腺指数和脾脏指数的影响[5] ①荷肝癌h22小鼠模型复制及分组：昆明种小鼠60只,雌雄各半，在无菌条件下取生长8天的小鼠移植型肝癌h22腹水，用ns稀释调整瘤细胞数为每毫升1×107的细胞悬液，取其中50只小鼠,右腋皮下接种瘤细胞悬液每只0.2ml，造成荷瘤动物模型。然后于全部小鼠腹部去毛，范围约3cm×3cm，将5%dncb丙酮液每只0.1ml均匀涂抹致敏，24小时后按体重随机分为6组：空白对照组(等容积ns)、模型组(等容积ns)、5fu组(0.02g·kg-1)、cci高剂量组(9.45g·kg-1)、cci中剂量组(4.72g·kg-1)、cci低剂量组(2.36g·kg-1)，每组10只，每日腹腔给药1次，每次0.15ml·10g-1体重，连续10天。②dth的产生与测定：末次给药后每鼠左耳用1% dncb丙酮液0.02ml进行涂布攻击，右耳作对照，24小时后脱颈处死小鼠，称体重，剪下两耳，用内径6mm打孔器同部位取耳片,电子天平称重。以左右耳片的重量差作为肿胀度，比较各组间差异。同时取胸腺、脾脏称重，计算胸腺指数和脾指数。
胸腺或脾指数＝胸腺（或脾脏）重量（mg）/体重（g）
1.5.2 cci对荷肝癌h22小鼠血清il2和tnfα水平的影响 ①荷肝癌h22小鼠模型复制及分组：昆明种小鼠60只，雌雄各半，无菌条件下取生长8天的小鼠移植型肝癌h22腹水，用ns稀释调整瘤细胞数为每毫升1×107的细胞悬液，取其中50只小鼠，右腋皮下接种瘤细胞悬液每只0.2ml，24小时后按体重随机分为6组：空白对照组(等容积ns)，模型组(等容积ns)、5fu组(0.02g·kg-1)、cci高剂量组(9.45g·kg-1)、cci中剂量组(4.72g·kg-1)、cci低剂量组(2.36g·kg-1)，每组10只，每日腹腔给药1次，每次0.15ml·10g-1体重，连续7天。②放免法测定血清il2和tnfα的含量：末次给药后24小时摘除小鼠眼球取血分离血清，按试剂盒说明用放免法测定血清il2和tnfα的含量。
1.6 数据分析与处理实验数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用spss11.5统计软件，两组间比较采用单因素方差分析（oneway anova）中lsd方法，p＜0.05有显著性差异。
2 结果
2.1 cci对荷肝癌h22小鼠耳廓肿胀度、胸腺指数和脾脏指数的影响与空白对照组比较，模型组小鼠耳廓肿胀度、胸腺指数和脾脏指数均明显降低，差异显著（p＜0.05）；与模型组比较，cci高、中剂量可使小鼠耳廓肿胀度、胸腺指数和脾脏指数均明显增加，差异显著（p＜0.05）；5fu可使小鼠耳廓肿胀度、胸腺指数和脾脏指数均明显降低，差异显著（p＜0.05）（表1）。表1 对荷肝癌h22小鼠耳肿胀度和脏器指数的影响
2.2 对荷肝癌h22小鼠血清il2和tnfα水平的影响与空白对照组比较，模型组il2和tnfα值明显降低，差异显著（p＜0.05）；与模型组比较，cci各个剂量可使il2和tnfα值明显增加，差异显著（p＜0.05）；5fu可使il2和tnfα值明显下降，差异显著（p＜0.05）；（表2）。表2 cci对荷肝癌h22小鼠血清il2和tnfα水平的影响
3 讨论
免疫器官的重量指数是衡量机体免疫功能的初步观察指标。脾是机体内最大的外周免疫器官，其中b细胞约占55%，抗原刺激活化后，再经克隆扩增，细胞数量明显增加，致b细胞区体积扩大，脾体积亦相应地扩大。给药后小鼠脾指数显著提高，提示药物能刺激小鼠脾脏增生，活化周围免疫器官的b细胞，增加抗体产生细胞的数量，增强小鼠的体液免疫功能[6]。胸腺为t细胞发育成熟的场所，主要参与细胞免疫。胸腺指数的升高显示给药后t细胞的增殖分化更加活跃。而且dth是依赖t细胞的反应，dth反应增强则进一步证明cci能够提高由dth反应所表达的t细胞免疫功能。卢素琳等[3]研究发现：复方斑蝥注射液可以增强荷s180小鼠dncb所致的迟发型超敏反应，提高血清溶血素抗体水平。本研究结果显示：荷肝癌h22模型小鼠耳廓肿胀度、胸腺指数和脾脏指数均较空白对照组明显降低，差异显著（p＜0.05），提示荷肝癌h22小鼠的细胞免疫功能受到抑制；而与模型组比较，cci高、中剂量可使小鼠耳廓肿胀度、胸腺指数和脾脏指数均明显增加，差异显著（p＜0.05），提示cci可提高荷肝癌h22小鼠的细胞及体液免疫功能。
细胞因子在调节抗癌免疫反应中起着重要的作用。il2是一种由活化的t细胞，特别是cd4+产生的细胞因子，可通过调节免疫系统的功能而发挥抗肿瘤作用[7]。它在免疫反应的激活和维持以及淋巴细胞的发育过程中起着重要的作用，对实体瘤的生长无直接抑制作用，其抗肿瘤活性可能与其促进淋巴细胞繁殖有关[8]。tnfα在体内能引起肿瘤细胞出血性坏死、瘤体缩小，抑制肿瘤细胞生长和增殖。唐斓等[9]通过酶联免疫吸附法测得复方斑蝥注射液有效增加荷h22瘤balb/c小鼠血清中il2和tnfα的含量。而本研究用放射免疫法测定血清il2和tnfα的含量，结果发现模型组与空白对照组比较il2和tnfα值明显降低，差异显著（p＜0.05）；与模型组比较，cci各个剂量可使il2和tnfα值明显增加，差异显著（p＜0.05）。提示cci可能是通过增加了血清中il2和tnfα的含量，从而提高荷肝癌h22小鼠的免疫功能来发挥抗肿瘤作用[10]。
综上实验结果表明：cci能够改善荷肝癌h22小鼠的免疫功能，恢复因荷瘤而受到损伤的机体免疫系统而发挥抗肿瘤作用。这可能是cci中人参、黄芪、刺五加等扶正固本类的中药发挥作用的结果。
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