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体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因

2015-10-06 14:37 来源:学术参考网 作者:未知

【摘要】 目的: 筛选能高效抑制乳腺癌细胞株mcf7和mdamb453端粒逆转录酶(htert)基因表达的rna干扰靶点,为乳腺癌的基因治疗提供依据. 方法: 构建针对htert基因的三种sirna(sirnahtert1, sirnahtert2和sirnahtert3),分别转导入乳腺癌细胞株mcf7和mdamb453,同时以无同源性的sirnahtert4作阴性对照,含gfp基因的载体作阳性对照. 应用实时聚合酶链反应(realtime pcr)和western blot技术检测sirna处理前后htert基因表达变化;mtt法检测细胞生长率;流式细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响. 结果: 与阴性对照组相比,sirnahtert1,sirnahtert2和sirnahtert3三个实验组sirna转染细胞后,htert的mrna表达量下调至21%~40%,蛋白表达下降至50%,而三个实验组间差异无统计学意义(p>0.05). 转染48 h 后,mcf7细胞抑制率分别为(57±4.3)%,(61±4.3)%,(65±6.0)%;mdamb453细胞抑制率分别为(45±5.1)%,(45±4.1)%,(50±4.0)%. 流式细胞仪检测结果显示,细胞凋亡率有所增加,mcf7细胞为(18.90±0.11)%,(27.30±0.18)%,(27.00±0.16)%;mdamb453细胞为(12.25±0.17)%,(17.80±0.19)%,(20.60±0.21)%. 结论: 经sirnahtert1,sirnahtert2,sirnahtert3处理均可明显抑制mcf7和mdamb453乳腺癌细胞的增殖及htert基因的表达,能够明显促进细胞的凋亡.

【关键词】 乳腺肿瘤;端粒酶逆转录酶;rna干扰

0引言

端粒逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,htert)是端粒酶组成的亚单位,与肿瘤的发生、发展密切相关[1-2]. 新近的研究[3-4]表明,应用小片段干扰rna(sirna)沉默或下调htert表达,可降低端粒酶的活性,缩短端粒,从而使肿瘤细胞的生长受到抑制[5-6]. 不同sirna转染效率的不同以及靶向htert的不同,sirna对端粒酶活性抑制的程度也有所不同[7]. 本研究拟通过设计多对靶向htert基因的sirna,转导入不同的乳腺癌细胞株,筛选出具有特异性下调htert基因表达的sirna,旨在为乳腺癌的基因治疗提供依据.

1材料和方法

1.1材料乳腺癌mcf7和mdamb453细胞株(上海细胞生物研究所);lipofectaminetm2000转染试剂,总rna提取试剂trizol,realtime pcr试剂盒(大连takara公司);兔抗htert多克隆抗体,辣根酶标记羊抗兔igg(美国sigma公司);co2孵育箱(hepa class 100, 德国thermo公司);实时荧光定量(realtime) pcr仪(light cycle,美国roche公司);流式细胞仪(epics xl,美国coulter beckma公司);蛋白电泳和电转仪(ve186,中国上海天能科技有限公司).

1.2方法

1.2.1sirna设计根据htert基因的dna序列(genbank accession no.nm_198255.1)设计出互补的3对(sirnahtert1,sirnahtert2和sirnahtert3)sirna序列[8],sirnahtert4为无同源性的阴性对照序列. sirna片段由广州锐博生物科技有限公司合成,其序列为:sirnahtert1正义链:5′ggagcagcugcggcccuccdtdt3′,反义链:5′dtdtccucgucgacgccgggagg3′;sirnahtert2正义链:5′aagagggccgagcgucucadtdt3′,反义链:5′dtdtuucucc cggcucgcagagu3′; sirnahtert3正义链:5′ugauuucuuguuggugacadtdt3′,反义链:5′dtdtacuaaagaacaaccacugu3′;sirnahtert4正义链:5′ggcctagctgcgcgagu3′,反义链:5′ggcctcagctgcgcgacga3′.

1.2.2sirna转染转染前1 d,换取新鲜培养液后调整密度为2×108个/l,待细胞生长至60%~80%融合时,将sirna脂质体混合物(100 μg/5 l)转染至细胞中,在37℃,50 ml/l co2无血清、无抗素培养液培养16~18 h,换新鲜100 ml/l胎牛血清培养基,继续培养2~5 d后检测各指标. 实验分为空白对照组(不含转染试剂和sirna);阴性对照组(sirnahtert4处理);阳性对照组(含gfp基因的载体处理)和三个实验组(sirnahtert1,sirnahtert2和sirnahtert3处理).

1.2.3sirnahtert转染乳腺癌细胞株后htert表达变化的检测

1.2.3.1实时聚合酶链反应(realtime pcr)分别收集各组转染后48 h的细胞,提取细胞总rna,逆转录成cdna. 取rt产物作为模板,进行realtime pcr,检测htert引物为:正义5′ccgtctgcgtgaggagatc3′, 反义5′tccggtagaaaaagagcctgtt3′;htert taqman探针:5′(fam)ggccaagttcctgcactggctgact(tamara)3′;gapdh引物:正义5′ccaggtggtctcctctgactt3′,反义5′gttgctgtagccaaattcgttgt3′;gapdh taqman探针:5′(fam)aacagcgacacccactcctccacc(eclipse)3′. realtime pcr反应体系为20 μl,包括:2×premix ex tagtm缓冲液10 μl,10 μmol/l上下游引物各0.4 μl,探针0.8 μl, cdna 2 μl,加双蒸水补足至20 μl. 反应条件:95℃ 10 s预变性后,95℃ 5 s,60℃ 20 s,共40个循环,每个样本设三个平行反应. gapdh作为内参对照校正上样量. 以2(δδct) 方法计算htert mrna的相对表达量.

1.2.3.2免疫印迹(western blot)检测分别收集转染48 h后的各组细胞,用预冷的pbs进行洗涤,加入蛋白裂解液进行裂解,提取总蛋白. 分别取50 μg蛋白,变性后经100 ml/l sdspage分离,将凝胶置转移缓冲液中平衡15 min,再80 v 1.5 h湿转印蛋白到pvdf上, 100 ml/l fbs/tbst 4℃封闭过夜,加一抗,37℃震荡温育1 h, tbst漂洗3次,每次15 min,加hrp标记二抗,37℃震荡温育1 h, tbst漂洗3次,每次15 min. 取等量的ecl发光试剂a,b液混匀后孵育硝酸纤维素膜,压曝光,以βactin为内参.

1.2.4mtt法检测取对数生长期细胞,经2.5 g/l胰蛋白酶消化,用含100 ml/l新生牛血清的dmem培养液配成单个细胞悬液,以每孔3×103个细胞接种96孔培养板中,加入培养液200 μl,37℃,50 ml/l co2培养箱培养. 次日进行瞬时转染,分别在转染后24,48,72,96 h进行检测. 检测时每孔中加入5 g/l mtt 20 μl,继续培养4 h,到达检测点时弃去培养液,再加入dmso 200 μl,震荡10 min,于自动酶标仪492 nm波长处测定各孔吸光度(a)值. 按照公式计算细胞生长抑制率. 抑制率(%)=[(对照组a492 nm-实验组a492 nm) /对照组a492 nm]×100%.

1.2.5细胞调亡的流式细胞术检测收集转染后48 h各组细胞,预冷pbs洗涤2次,用预冷的1×结合缓冲液重悬细胞,调整终密度为5×109个/l,将试管置于冰上,加5 μl的annexin vfitc溶液和2.5 μl的碘化丙啶(propidium iodide, pi )至100 μl的细胞悬液中,避光孵育10 min后,加入400 μl冰预冷的1×结合缓冲液,30 min内用流式细胞仪进行检测,分析各组细胞的凋亡情况.

统计学处理:采用spss11.0统计分析软件,细胞增殖实验中各处理组与对照组进行配对t检验,各实验组间进行f检验. p<0.05为差异具有统计学意义.

2结果

2.1sirna转染后绿荧光蛋白的表达倒置显微镜明视野下,阴性对照组和阳性对照组细胞生长正常,形态无明显变化;倒置荧光显微镜暗视野下,阳性对照组的部分细胞胞内呈现绿色(图1).

a,c: 转染含gfp基因的载体后mcf7和mdamb453细胞表达绿荧光蛋白; b,d: 明视野下mcf7和mdamb453细胞的生长形态.

图1倒置荧光显微镜下mcf7和mdamb453细胞的绿荧光蛋白表达×400

2.2转染后细胞htert表达的变化以阴性对照组原始模板的相对浓度为标准,经 sirnahtert1,2和3转染后,htert mrna的相对表达量,mcf7细胞分别为:35%,30%,31%;mdamb453细胞分别为36%,33%,21%,sirnahtert1,2和3三个实验组间进行h检验,组间差异无统计学意义(p=0.368,p>0.05). western blot检测结果显示,sirnahtert1,2和3三个实验组蛋白表达明显降低(p=0.00),与阴性对照组相比较,三组间差异无统计学意义(p=0.223,p>0.05,图2). 经sirnahtert1,2,3和4处理后,htert蛋白条带灰度mcf7细胞分别为35%,25%,24%,76%;mdamb453细胞分别29%,23%,29%,70%.

2.3转染后细胞增殖的变化48 h后sirnahtert1,2和3三个实验组和阴性对照组对mcf7细胞的抑制率分别为(57±4.3)%,(61±4.3)%,(65±6.0)%,(5.3±3.5)%;对mdamb453细胞的抑制率分别为(45±5.1)%,(45±4.1)%,(50±4.0)%,(6.7±3.6)%. 配对t检验分析果显示,sirnahtert1,2和3三个实验组对mcf7细胞的生长抑制明显高于阴性对照组(p=0.023,0.016,0.028);对mdamb453细胞的生长抑制也明显高于阴性对照组(p=0.024,0.018,0.027),但三个实验组间的变化不明显(p=0.075, 0.085).

2.4基因沉默对细胞凋亡的影响sirnahtert1,2和3转染mcf7和mdamb453细胞48 h后,流式双标记检测结果显示,与阴性对照组相比较,annexin 单染和annexinv/pi双染阳性细胞明显增加(f=124,p=0.00,图3). 其中,sirnahtert1,2和3三个实验组annexin 单染的细胞凋亡率mcf7细胞为(18.90±0.11)%,(27.30±0.18)%,(27.00±0.16)%;mdamb453细胞为(12.25±0.17)%,(17.80±0.19)%,(20.60±0.21)%.

3讨论

目前用针对疾病相关基因的sirna进行基因治疗已取得了一定的进展,已有几种rna技术新药进入临床实验,但尚未应用于肿瘤治疗. 有研究[9]发现htert基因在乳腺癌发生发展中起重要作用,目前有关抑制htert表达的研究多采用一种sirna作用于某一种肿瘤细胞. 本实验设计三种靶向乳腺癌细胞株htert基因的sirna,研究目的基因下调对细

a,b: mcf7细胞的阴性对照组和sirnahtert1组; c,d: mdamb453细胞的阴性对照组和sirnahtert1组. sirnahtert2和3组与sirnahtert1组相似. 图中左上象限: annexinv/pi双染区; 右下象限为annexin单染区. pi: 碘化丙啶; annexin v: 磷脂结合蛋白v.

胞生长的影响,结果显示,三种sirna都可下调htert基因表达,使mcf7和mdamb453两种乳腺癌细胞株的生长受到抑制. 但不同的sirna对同一基因的沉默效果存在差异,因此,在靶向基因htert的sirna选择和设计时,我们选择htert基因外显子不同区域、不同碱基含量的3对长度为19 bp的sirna片段,探讨不同靶点rna干扰效果的差异,转染结果表明,sirnahtert1,2和3三个实验组和对照组htert基因表达几乎无变化,sirnahtert1,2和3三种sirnahtert处理后htert的mrna和蛋白表达均明显下调. 同时,采用sirna转染来源不同的乳腺癌细胞株后,无论是mcf7还是mdamb453细胞株,经sirnahtert1,2和3三种sirna处理后,细胞增殖均受抑制,48 h后出现不同程度的调亡,这提示sirnahtert1,2和3三种sirna可较好的作用于不同来源的乳腺癌细胞,为rna干扰药物应用于乳腺癌治疗奠定了基础.

综上所述,本研究利用rnai技术筛选出3对sirna,均可特异性下调乳腺癌细胞株htert基因的表达;导入mcf7和mdamb453两种乳腺癌细胞株后,可明显抑制肿瘤细胞的增殖,使部分细胞发生调亡,这为乳腺癌基因治疗的临床研究提供了依据.

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