【摘要】 目的: 筛选能高效抑制乳腺癌细胞株mcf7和mdamb453端粒逆转录酶（htert）基因表达的rna干扰靶点，为乳腺癌的基因治疗提供依据. 方法: 构建针对htert基因的三种sirna(sirnahtert1, sirnahtert2和sirnahtert3)，分别转导入乳腺癌细胞株mcf7和mdamb453，同时以无同源性的sirnahtert4作阴性对照，含gfp基因的载体作阳性对照. 应用实时聚合酶链反应（realtime pcr）和western blot技术检测sirna处理前后htert基因表达变化；mtt法检测细胞生长率；流式细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响. 结果: 与阴性对照组相比，sirnahtert1，sirnahtert2和sirnahtert3三个实验组sirna转染细胞后，htert的mrna表达量下调至21%~40%，蛋白表达下降至50%，而三个实验组间差异无统计学意义（p>0.05）. 转染48 h 后，mcf7细胞抑制率分别为(57±4.3)%，（61±4.3）%，（65±6.0）%；mdamb453细胞抑制率分别为（45±5.1）%，（45±4.1）%，（50±4.0）%. 流式细胞仪检测结果显示，细胞凋亡率有所增加，mcf7细胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；mdamb453细胞为(12.25±0.17)%，（17.80±0.19）%，（20.60±0.21）%. 结论： 经sirnahtert1，sirnahtert2，sirnahtert3处理均可明显抑制mcf7和mdamb453乳腺癌细胞的增殖及htert基因的表达，能够明显促进细胞的凋亡.
【关键词】 乳腺肿瘤；端粒酶逆转录酶；rna干扰
0引言
端粒逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，htert）是端粒酶组成的亚单位，与肿瘤的发生、发展密切相关［1-2］. 新近的研究［3-4］表明，应用小片段干扰rna（sirna）沉默或下调htert表达，可降低端粒酶的活性，缩短端粒，从而使肿瘤细胞的生长受到抑制［5-6］. 不同sirna转染效率的不同以及靶向htert的不同，sirna对端粒酶活性抑制的程度也有所不同［7］. 本研究拟通过设计多对靶向htert基因的sirna，转导入不同的乳腺癌细胞株，筛选出具有特异性下调htert基因表达的sirna，旨在为乳腺癌的基因治疗提供依据.
1材料和方法
1.1材料乳腺癌mcf7和mdamb453细胞株(上海细胞生物研究所)；lipofectaminetm2000转染试剂，总rna提取试剂trizol，realtime pcr试剂盒（大连takara公司）；兔抗htert多克隆抗体，辣根酶标记羊抗兔igg（美国sigma公司）；co2孵育箱（hepa class 100, 德国thermo公司）；实时荧光定量(realtime) pcr仪（light cycle，美国roche公司）；流式细胞仪（epics xl，美国coulter beckma公司）；蛋白电泳和电转仪（ve186，中国上海天能科技有限公司）.
1.2方法
1.2.1sirna设计根据htert基因的dna序列（genbank accession no.nm_198255.1）设计出互补的3对（sirnahtert1，sirnahtert2和sirnahtert3）sirna序列［8］，sirnahtert4为无同源性的阴性对照序列. sirna片段由广州锐博生物科技有限公司合成，其序列为：sirnahtert1正义链：5′ggagcagcugcggcccuccdtdt3′,反义链：5′dtdtccucgucgacgccgggagg3′；sirnahtert2正义链：5′aagagggccgagcgucucadtdt3′,反义链：5′dtdtuucucc cggcucgcagagu3′； sirnahtert3正义链：5′ugauuucuuguuggugacadtdt3′,反义链：5′dtdtacuaaagaacaaccacugu3′；sirnahtert4正义链：5′ggcctagctgcgcgagu3′,反义链：5′ggcctcagctgcgcgacga3′.
1.2.2sirna转染转染前1 d，换取新鲜培养液后调整密度为2×108个/l，待细胞生长至60%～80%融合时，将sirna脂质体混合物（100 μg/5 l）转染至细胞中，在37℃，50 ml/l co2无血清、无抗素培养液培养16～18 h，换新鲜100 ml/l胎牛血清培养基，继续培养2～5 d后检测各指标. 实验分为空白对照组（不含转染试剂和sirna）；阴性对照组（sirnahtert4处理）；阳性对照组（含gfp基因的载体处理）和三个实验组（sirnahtert1，sirnahtert2和sirnahtert3处理）.
1.2.3sirnahtert转染乳腺癌细胞株后htert表达变化的检测
1.2.3.1实时聚合酶链反应（realtime pcr）分别收集各组转染后48 h的细胞，提取细胞总rna，逆转录成cdna. 取rt产物作为模板，进行realtime pcr，检测htert引物为：正义5′ccgtctgcgtgaggagatc3′, 反义5′tccggtagaaaaagagcctgtt3′；htert taqman探针：5′（fam）ggccaagttcctgcactggctgact（tamara）3′；gapdh引物：正义5′ccaggtggtctcctctgactt3′，反义5′gttgctgtagccaaattcgttgt3′；gapdh taqman探针：5′（fam）aacagcgacacccactcctccacc（eclipse）3′. realtime pcr反应体系为20 μl，包括：2×premix ex tagtm缓冲液10 μl,10 μmol/l上下游引物各0.4 μl,探针0.8 μl, cdna 2 μl,加双蒸水补足至20 μl. 反应条件：95℃ 10 s预变性后，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共40个循环，每个样本设三个平行反应. gapdh作为内参对照校正上样量. 以2(δδct) 方法计算htert mrna的相对表达量.
1.2.3.2免疫印迹（western blot）检测分别收集转染48 h后的各组细胞，用预冷的pbs进行洗涤，加入蛋白裂解液进行裂解，提取总蛋白. 分别取50 μg蛋白，变性后经100 ml/l sdspage分离，将凝胶置转移缓冲液中平衡15 min，再80 v 1.5 h湿转印蛋白到pvdf上， 100 ml/l fbs/tbst 4℃封闭过夜，加一抗，37℃震荡温育1 h, tbst漂洗3次，每次15 min，加hrp标记二抗，37℃震荡温育1 h, tbst漂洗3次，每次15 min. 取等量的ecl发光试剂a，b液混匀后孵育硝酸纤维素膜，压曝光，以βactin为内参.
1.2.4mtt法检测取对数生长期细胞，经2.5 g/l胰蛋白酶消化，用含100 ml/l新生牛血清的dmem培养液配成单个细胞悬液，以每孔3×103个细胞接种96孔培养板中，加入培养液200 μl，37℃，50 ml/l co2培养箱培养. 次日进行瞬时转染，分别在转染后24,48,72,96 h进行检测. 检测时每孔中加入5 g/l mtt 20 μl，继续培养4 h，到达检测点时弃去培养液，再加入dmso 200 μl，震荡10 min，于自动酶标仪492 nm波长处测定各孔吸光度（a）值. 按照公式计算细胞生长抑制率. 抑制率(%)=［(对照组a492 nm-实验组a492 nm) /对照组a492 nm］×100%.
1.2.5细胞调亡的流式细胞术检测收集转染后48 h各组细胞，预冷pbs洗涤2次，用预冷的1×结合缓冲液重悬细胞，调整终密度为5×109个/l，将试管置于冰上，加5 μl的annexin vfitc溶液和2.5 μl的碘化丙啶（propidium iodide, pi ）至100 μl的细胞悬液中，避光孵育10 min后，加入400 μl冰预冷的1×结合缓冲液，30 min内用流式细胞仪进行检测，分析各组细胞的凋亡情况.
统计学处理：采用spss11.0统计分析软件，细胞增殖实验中各处理组与对照组进行配对t检验，各实验组间进行f检验. p<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1sirna转染后绿荧光蛋白的表达倒置显微镜明视野下，阴性对照组和阳性对照组细胞生长正常，形态无明显变化；倒置荧光显微镜暗视野下，阳性对照组的部分细胞胞内呈现绿色（图1）.
a,c: 转染含gfp基因的载体后mcf7和mdamb453细胞表达绿荧光蛋白; b,d: 明视野下mcf7和mdamb453细胞的生长形态.
图1倒置荧光显微镜下mcf7和mdamb453细胞的绿荧光蛋白表达×400
2.2转染后细胞htert表达的变化以阴性对照组原始模板的相对浓度为标准，经 sirnahtert1，2和3转染后，htert mrna的相对表达量，mcf7细胞分别为：35%，30%，31%；mdamb453细胞分别为36%，33%，21%，sirnahtert1，2和3三个实验组间进行h检验，组间差异无统计学意义（p=0.368，p>0.05）. western blot检测结果显示，sirnahtert1，2和3三个实验组蛋白表达明显降低(p=0.00)，与阴性对照组相比较，三组间差异无统计学意义（p=0.223，p>0.05，图2）. 经sirnahtert1，2，3和4处理后，htert蛋白条带灰度mcf7细胞分别为35%，25%，24%，76%；mdamb453细胞分别29%，23%，29%，70%.
2.3转染后细胞增殖的变化48 h后sirnahtert1，2和3三个实验组和阴性对照组对mcf7细胞的抑制率分别为(57±4.3)%,（61±4.3）%,（65±6.0）%,（5.3±3.5）%；对mdamb453细胞的抑制率分别为（45±5.1）%,（45±4.1）%,（50±4.0）%,(6.7±3.6)%. 配对t检验分析果显示，sirnahtert1，2和3三个实验组对mcf7细胞的生长抑制明显高于阴性对照组（p=0.023，0.016，0.028）；对mdamb453细胞的生长抑制也明显高于阴性对照组（p=0.024，0.018，0.027），但三个实验组间的变化不明显（p=0.075, 0.085）.
2.4基因沉默对细胞凋亡的影响sirnahtert1，2和3转染mcf7和mdamb453细胞48 h后，流式双标记检测结果显示，与阴性对照组相比较，annexin 单染和annexinv/pi双染阳性细胞明显增加（f=124，p=0.00，图3）. 其中，sirnahtert1，2和3三个实验组annexin 单染的细胞凋亡率mcf7细胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；mdamb453细胞为(12.25±0.17)%,（17.80±0.19）%,（20.60±0.21）%.
3讨论
目前用针对疾病相关基因的sirna进行基因治疗已取得了一定的进展，已有几种rna技术新药进入临床实验，但尚未应用于肿瘤治疗. 有研究［9］发现htert基因在乳腺癌发生发展中起重要作用，目前有关抑制htert表达的研究多采用一种sirna作用于某一种肿瘤细胞. 本实验设计三种靶向乳腺癌细胞株htert基因的sirna，研究目的基因下调对细
a,b: mcf7细胞的阴性对照组和sirnahtert1组; c,d: mdamb453细胞的阴性对照组和sirnahtert1组. sirnahtert2和3组与sirnahtert1组相似. 图中左上象限: annexinv/pi双染区; 右下象限为annexin单染区. pi: 碘化丙啶; annexin v: 磷脂结合蛋白v.
胞生长的影响，结果显示，三种sirna都可下调htert基因表达，使mcf7和mdamb453两种乳腺癌细胞株的生长受到抑制. 但不同的sirna对同一基因的沉默效果存在差异，因此，在靶向基因htert的sirna选择和设计时，我们选择htert基因外显子不同区域、不同碱基含量的3对长度为19 bp的sirna片段，探讨不同靶点rna干扰效果的差异，转染结果表明，sirnahtert1，2和3三个实验组和对照组htert基因表达几乎无变化，sirnahtert1，2和3三种sirnahtert处理后htert的mrna和蛋白表达均明显下调. 同时，采用sirna转染来源不同的乳腺癌细胞株后，无论是mcf7还是mdamb453细胞株，经sirnahtert1，2和3三种sirna处理后，细胞增殖均受抑制，48 h后出现不同程度的调亡，这提示sirnahtert1，2和3三种sirna可较好的作用于不同来源的乳腺癌细胞，为rna干扰药物应用于乳腺癌治疗奠定了基础.
综上所述，本研究利用rnai技术筛选出3对sirna，均可特异性下调乳腺癌细胞株htert基因的表达；导入mcf7和mdamb453两种乳腺癌细胞株后，可明显抑制肿瘤细胞的增殖，使部分细胞发生调亡，这为乳腺癌基因治疗的临床研究提供了依据.
【参考文献】
［1］ yang g, rosen dg, colacino ja, et al. disruption of the retinoblastoma pathway by small interfering rna and ectopic expression of the catalytic subunit of telomerase lead to immortalization of human ovarian surface epithelial cells［j］. oncogene, 2007, 26(10):1492-1498.
［2］ park yp, choi sc, kim jh, et al. upregulation of mac2 binding protein by htert in gastric cancer［j］. int j cancer, 2007, 120(4): 813-820.
［3］ 周唏，张鹏辉. sirna稳定抑制肝癌细胞htert基因的表达［j］. 第四军医大学学报，2005,26（24）:2233-2236.
［4］ 赵英，任君琳，孟艳玲，等. htert sirna表达载体的构建及对转染的hela细胞生长抑制［j］. 第四军医大学学报，2005，26（9）：828-830.
［5］ kurvinen k, syrjnen s, johansson b. longterm suppression of telomerase expression in hela cell clones, transfected with an expression vector carrying sirna targeting htert mrna［j］. int j oncol, 2006, 29(1):279-288.
［6］ zhang ph, zou l, tu zg. rnaihtert inhibition hepatocellular carcinoma cell proliferation via decreasing telomerase activity［j］. surg res, 2006,131:143-149.
［7］ gandellini p, folini m, bandiera r, et al. downregulation of human telomerase reverse transcriptase through specific activation of rnai pathway quickly results in cancer cell growth impairment［j］. biochem pharmacol, 2007,73(11):1703-1714.
［8］ arziman z, horn t, boutros m. ernai: a web application to design optimized rnai constructs［j］. nucleic acids res, 2005, 33:582-588.
［9］ cejka d, losert d, wacheck v. short inerfering rna(sirna): tool or therapeutic?［j］. clin sci, 2006,110:47-58.
