【关键词】 ,螺杆菌
关键词: 螺杆菌，幽门;粘附素alpA;克隆，分子;基因表达
摘 要:目的 克隆并表达幽门螺杆菌粘附素AlpA基因. 方法 提取幽门螺杆菌染色体基因，用PCR方法扩增alpA基因，将其克隆至表达载体pET-22b(+)，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达. 结果 分离得到了1.5kb的alpA基因片段，并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达，在37℃诱导表达3h后，表达产物占细菌总蛋白的31.9%.表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在，其中主要是包涵体的形式，目的蛋白占不溶性蛋白的64.8%. 结论 幽门螺杆菌alpA基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础.
Keywords:helicobacter pylori;adhesion alpA;cloning mole-cular;gene expression
Abstract:AIM To isolate and expresse alpA gene from He-licobacter pylori.METHODS The alpA gene was amplified from H.pylori chromosomal by PCR and inserted into the prokaryotie expression vector pET-22b(+).The recombinant plasmid was transformed into the BL21(DE3)E.coli strain.RESULTS 1.5kb alpA gene was successfully isolated.Re-combinant E.coli strains expressed AlpA were obtained，the expression protein amounted to31.9%of the total bacterial protein after induced with IPTG for3h at37℃.CONCLU┐SION Cloning and high-expression of alpA gene lay the foundation for the development of the H.pylori vaccine.
0 引言
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)已被确认是慢性胃病(包括胃炎和消化性溃疡)的主要病原因子，同时与胃腺癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生亦密切相关[1-6] .目前根除Hp的主要手段是抗菌疗法，但有相当的局限性.疫苗接种最有效，在Hp疫苗的研制中，获得了不同程度的保护作用，但仍不理想.如从粘附素出发寻找保护性抗原从而阻断Hp对于胃粘膜的粘附，使之在胃蠕动时随食物一起被排空，也许是一种有益的尝试.AlpA是已被证实的Hp粘附素中的一种[7] ，目前国内尚未见有关的研究报道.我们对粘附素AlpA的基因进行了克隆和表达，为构建Hp基因工程疫苗打下了基础.
1 材料和方法
1.1 材料 菌株BL21(DE3)、质粒pET-22b(+)和幽门螺杆菌SS1为本所保存.限制性内切酶NotⅠ，NocⅠ及T4DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶购自New England Biolabs公司，Taq DNA聚合酶、DNA相对分子质量标准λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ购自华美生物工程公司，琼脂糖、dNTPs、DNA快速纯化试剂盒购自Promega公司，测序质粒纯化试剂盒购自德国Qiagen公司，其他试剂为国产分析纯.
1.2 方法 从固体培养基上刮取生长良好的Hp菌落，按基因组DNA小量制备法提取Hp染色体DNA.质粒的快速抽提及大量制备均采用碱变性法.根据文献[8]设计引物，在其5’端加上合适的限制性酶切位点，由博亚公司合成.序列如下:AlpA1:5’-TG G CC ATG GAT TGC GCT AGC ATA AGT TA-3’NocⅠAlpA2:5’-AG T GC GGC CGC GAA TGA ATA CCC ATA AGA-3’NotⅠ热启动法进行PCR，95℃变性30s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环后再延伸10min.8g・L-1 琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果.质粒和目的基因DNA经NotⅠ和NocⅠ双酶切，玻璃奶回收酶切片段，T4连接酶作用下16℃连接12h，转化宿主菌BL21(DE3).重组转化子经筛选和鉴定后，采用373A DNA自动分析仪进行全自动测序.AlpA阳性克隆经IPTG诱导表达后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.外周质部分表达产物:4℃，12000g离心1min，收集IPTG诱导培养物.将细菌沉淀重悬于30mmol・L-1 Tris-CL(pH8.0)～1mmol・L-1 ～ED-TA-200g・L-1 蔗糖中，冰浴10min，以12000g离心10min，上清即为外周质部分.胞内可溶性和包涵体部分:同上法收集IPTG诱导培养物菌体.弃上清，菌体沉淀重悬于1/10体积的PBS中，在冰浴条件下超声破碎至溶液较清亮，以12000g于4℃离心15min，上清即为胞内可溶性部分，沉淀为包涵体部分.
2 结果
2.1 粘附素AlpA基因片段的序列 粘附素AlpA基因PCR扩增结果电泳分析发现在1500bp左右有一条带，大小与预计相符(Fig1).将PCR产物经NotⅠ和NocⅠ双酶切后，定向插入经同样双酶切的pET-22b(+)载体中，获得重组质粒命名为pET-22b(+)/AlpA(Fig1).重组质粒经NotⅠ和NocⅠ双酶切后电泳初步鉴定结果与预期相符.直接以重组质粒pET-22b(+)/AlpA为模板进行测序，得到了克隆片段的DNA序列，与Odenbreit等[6] 报道的几乎一致，同源性高达97.3%.
2.2 粘附素AlpA基因在大肠杆菌中的表达 将粘附素AlpA阳性克隆株在LB培养液(含100mg・L-1 氨苄青霉素)中37℃过夜培养，然后按1%转接至含氨苄青霉素的LB培养液中，继续培养至A值为0.6～0.8，加IPTG至终浓度为0.1mmol・L-1 ，诱导表达3h，离心收集菌体，取其周质的渗透休克液、菌体超声后的上清以及沉淀进行100g・L-1 SDS-PAGE电泳分析(Fig2).结果发现，经诱导后表达Mr 为56500的蛋白，与预期一致，凝胶自动扫描分 析，其粘附素AlpA重组蛋白占菌体总蛋白的31.9%，其中可溶性表达占上清的23.7%，包涵体占沉淀的64.8%.
图1 - 图2 略
3 讨论
在当前以尿素酶B亚单位为主的多种候选抗原预防幽门螺杆菌感染效果不确定的情况下[9] ，提示我们需发现新的保护性抗原.有关文献表明[10] ，外膜蛋白(OMP)和膜孔素也许是优秀的疫苗候选成分，而AlpA正符合上述要求:①AlpA与Hp外膜蛋白膜孔素家族的HopC的同源性高达97.2%;②体外粘附实验表明AlpA位于细菌表面.此外，AlpA作为基因工程疫苗的候选抗原还具有下列优点:①位于细菌表面从而为免疫反应提供靶位;②作为粘附素为Hp致病所必须，具有较高的保守性，而保守抗原通常为疫苗构建的首选抗原;③尽管是Hp致病的必须成分，但本身无毒性且与人组织抗原无交叉反应;④因其成分为蛋白质，从而能够通过构建基因工程疫苗实现大规模生产和纯化.这些优点符合Har-ry等[11] 在1998年提出的Hp疫苗抗原的标准.
我们在设计引物时去掉了AlpA信号肽序列，为便于下一步的表达和纯化，又将其装入了带有组氨酸尾巴的融合表达载体.PCR、酶切鉴定和测序结果显示获得了特异的Hp的alpA基因，蛋白电泳分析表明获得了高效表达Hp AlpA的克隆株，为进一步研究其粘附机制和免疫保护作用奠定了重要的基础.
参考文献:
[1]Liu XF，Hu JL，Peng DR，Song BH，Ji WS，Sun YQ.Estab-lishment of attenuated salmonella typhimurium producing heli-cobacter pylori urease subunits B [J].Di-si Junyi DaxueXuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(8):1012-1014.
[2]Peng DR，Sun YQ，Hu JL，Yu WB，Qiao W，Xu XL.Study on infection rate and resistance of Helicobacter pylori from patients with gastroenteric disease [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(10):1250-1252.
[3]Chen JK，Zhu YL，Zhang WH，Zhao YF，Zhong YQ，Cao YX，Wang YK.Existence and distribution of IL-8R immunopositive cells in digestive tract of rats [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(4):440-442.
[4]Wu XH，Duan W，Wang L，Kang N，Ma ML，Li M.The ret-rospective analysis on36bleeding patients of peptic ulcer [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，1999;20(6):474.
[5]Han FC，Yan XJ，Hou Y.Establishment of a dot immunogold filtration assay for rapid detection of anti-VacA [J].Di-si Junyi Daxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ)，2000;21(4):498.
[6]Tsang KW，Lam SK.Helicobacter pylori and extra-digestive diseases [J].J Gastroenterol Hepatol，1999;14:844-850.
[7]Peck B，Ortkamp M，Diehl KD，Hundt E，Knapp B.Conserva-tion，localization and expression of HopZ，a protein involved in adhesion of Helicobacter pylori [J].Nucleic Acids Res，1999;27:3325-3333.
[8]Odenbreit S，Till M，Hofreuter D，Faller G，Haas R.Genetic and functional characterization of the AlpAB gene locus essential for the adhesion of Helicobacter pylori to human gastric tissue [J].Mol Microbiol，1999;31:1537-1548.
[9]Solnick JV，Canfield DR，Hansen LM，Torabian SZ.Immuniza-tion with recombinant Helicobacter pylori urease in specific-pathogen-free rhesus monkeys(Macaca mulatta)[J].Infect Immun，2000;68:2560-2565.
[10]Del Giudice G，Covacci A，Telford JL，Montecucco C，Rappuoli R.The design of vaccines against Helicobacter pylori and their development [J].Annu Rev Immunol，2001;19:523-563.
[11]Kleanthous H，Lee CK，Monath TP.Vaccine development a-gainst infection with Helicobacter pylori [J].Br Med Bull，1988;54:229-241.
