【关键词】 信号分子
关键词: 信号分子;鸟苷酸类;PH结构域;蛋白激酶C;活性
摘 要:目的 鉴定表达guanine-nucleotide-releasing factor（GRF）的pleckstrin homology（PH）结构域与谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白的可溶性，并进一步检测该重组蛋白与蛋白激酶C（PKC）的结合及对PKC活性的影响. 方法 将表达GRF的PH结构域与GST融合蛋白的菌体经超声裂解，上清中的融合蛋白用琼脂糖珠锚定纯化.Western blot检测融合蛋白与PKC的结合，以PKC活性检测试剂盒测定结合后PKC的活性变化. 结果 获得信号分子GRF的PH结构域-GST融合蛋白的可溶性表达.Western blot结果表明，GRF的PH结构域可在体外与PKC结合.PKC活性实验显示，GRF的PH结构域抑制PKC活性. 结论 GRF的PH结构域可在体外与PKC结合并对PKC的活性具有下调作用.
Keywords:signaling molecule;guanine-nucleotide-releasing factor for Ras;PH domain;protein kinase C;ac-tivity
Abstract:AIM To investigate association of guanine-nu-cleotide-releasing factor for Ras（GRF）PH domain and pro-tein kinase C（PKC）and to examine effect of GRF PH do-main on activity of protein kinase C.METHODS GRF PH domain-GST fusion protein was expressed in E.coli and puri-fied by glutathione agarose beads.The expressed fusion pro-Tel.（029）3374516 Email.jishaoping@hotmail.com tein was harvested by lysing the E.coli with ultrasonic.After centrifugation，the fusion protein in supernatant was purified by glutathione agarose beads.Western blot was employed to confirm the binding of the PH domain with PKC in vitro.To detect change of PKC activity after the fusion protein binding to PKC，PKC activity was examined with TECTTM PKC as-say system.RESULTS Association of PKC with GRF PH domain was detected out by Western blot，and the PH do-main down-regulated the activity of PKC.CONCLUSION Recombinant GRF PH domain binds to PKC and inhibits its kinase activity in vitro.
0 引言
我们以前克隆表达了GRF（guanine-nucleotide-releasing factor for Ras）的PH结构域［1］ ，现进一步研究其与PKC间的相互调节关系.GRF属小G蛋白家族，大鼠GRF由1244个氨基酸构成，其中包括两个PH结构域，分别位于22～129位和452～580位氨基酸［2］ .Ras蛋白是多种信号转导途径的核心.许多受体信号经过一系列的细胞内转导，在小G蛋白家族的介导下使GTP与Ras蛋白结合并激活Ras，从而启动Ras-Raf-MAPK信号系统［3］ .当用Ras抗体或将Ras突变可明显阻断这些受体所介导的功能.在这一过程中，GTP与Ras蛋白结合可由GRF催化［2］ .另一方面，GRF能刺激GDP与Ras的解离，促使GTP与Ras的结合.将GRF和Ras共表达于COS7细胞，可检测到GTP结合形式Ras的聚集［4］ .目前，有关GRF与PKC之间相互作用我们所知甚少.对于MAPK信号转导途径的许多信号是经由Ras向下传递的，已知GRF能催化GDP-Ras转变成GTP-Ras形式从而激活Ras，这其中除了GRF外，SOS-1对Ras也具有激活作用.在许多信号转导途径中处于重要位置的PKC，其介导的信号转导通路可看作是不同于MAPK信号途径的另一信号转导通路，但研究却发现PKC也对Ras有激活作用［5］ .与GRF及SOS-1相比，PKC对Ras的激活方式以及激活后的效应是不同的［6］ .有关PKC对GRF的激活机制尚有待进一步研究.
1 材料和方法
1.1 材料 中分子质量蛋白质分子质量参照物购自华美公司，蛋白酶抑制剂购自Promega公司，其他试剂盒的来源在随后注明.PGEX-4T-1载体和DH5α菌株为本教研室保存.
1.2 表达蛋白的可溶性鉴定及纯化 以超声波破碎已表达GRF PH结构域-RST融合蛋白的菌体，4℃，2×1min.离心（12000g，4℃20min）.分别取50μL上清（留上清备用）和全部沉淀（沉淀约占总体积的1%～2%），加入2×上样缓冲液50μL，按常规方法进行SDS-PAGE.将上清，以谷胱甘肽偶联的琼脂糖珠纯化所表达的融合蛋白，多次离心漂洗后取沉淀.通过SDS-PAGE，调整各组蛋白质的浓度（以电泳后蛋白质条带的粗细为参照，用宿主菌上清作稀释液），使之接近一致，以避免非特异结合造成的差异.
1.3 Jurkat细胞的培养及裂解 将人T细胞白血病细胞系Jurkat接种于RPMI1640培养基（含100mL・L-1 的胎牛血清），于37℃50mL・L-1 CO2 条件下培养.收集细胞（约2×107 ），加入2mL NP-40细胞裂解液（10g・L
-1 NP-40，20mmol・L-1 Tris-HCl，pH8.0，150mmol・L-1 NaCl，0.2g・L-1 NaN3 ，0.1mmol・L-1 CaCl2 ，用前加入0.17g・L-1 aprotinin，1.0mmol・L-1 PMSF），震荡1min，离心（14000g，4℃，10min），取上清于4℃备用.
1.4 Western印迹鉴定PH结构域与PKC的结合 取琼脂糖珠混悬液加入Jurkat细胞上清，孵育后，经离心洗涤.常规方法进行Western印迹.按检测试剂盒ECL（Amersham公司的化学发光试剂盒）的说明方法进行，于暗室条件下压上X光片，感光10min.
1.5 PKC激酶活性测定 取1.2制备的上清加入50μL洗脱液（10mmol・L-1 还原型谷胱甘肽，50mmol・L-1 Tris-HCl，pH8.0，）37℃，1h，离心后取上清，加入等体积1.3制备的Jurkat细胞上清，4℃，1h.随后按PKC活性测定试剂盒（购自Promega公司）说明的方法操作.以液闪计数仪（Beckman公司）测定各样品的cpm值.计算PKC活性的相对值.
2 结果
2.1 表达蛋白溶解状态及纯化 将诱导培养后的菌体重悬，以超声破碎法裂解，取全部沉淀（约50μL）及50μL上清.变性后，各取15μL上样进行SDS-PAGE.结果显示，上清和沉淀中有粗细相近的表达 的蛋白质条带（Fig1）.因沉淀物的体积约占总体积的2%，故所表达的目的蛋白质大部分是可溶性的，占目的蛋白总量的95%以上.表达的融合蛋白经谷胱甘肽偶联的琼脂糖珠“锚定”纯化，SDS-PAGE显示已得到较高纯度的蛋白质（Fig2）.经反复SDS-PAGE，以电泳条带粗细为参照，将各样品浓度调整接近一致（Fig3），以避免在结合实验中非特异结合造成的差异.
图1 －图2 略
2.2 GRF PH结构域在体外与PKC结合及其活性 纯化的GRF PH结构域与PKC孵育后，经离心洗涤，进行SDS-PAGE.用抗PKCβ1 抗体及来自羊抗兔的抗体作为二抗，以化学发光显影法检测.West-ern印迹结果显示，GRF PH结构域（Fig4a）同Btk PH结构域（Fig4d）一样［7］ ，在其泳道检测到PKC的存在;而单纯的GST（Fig4e）泳道未检测到PKC的存在，表明GRF的PH结构域在体外可与PKC结合.GRF PH结构域与PKC结合后，以PKC活性测定试剂盒测定了对PKC活性的影响.结果表明，与GST相比，GRF PH结构域对PKC的活性具有抑制作用，Btk的PH结构域对PKC的活性具有刺激作用（Fig5）.
图3 －图5 略
3 讨论
有关GRF与PKC之间相互作用目前所知甚少， 对于Ras-Raf-MAPK信号转导系统的许多信号是必须经由Ras向下传递，Ras在这一系统中处于重要地位.已知GRF能催化GDP-Ras转变成GTP-Ras形式从而激活Ras［8］ ，这一过程，除了GRF外，SOS-1和Vav等对Ras也具有激活作用，这些分子均参与了对Ras-Raf-MAPK信号转导系统的调节.在许多信号转导途径中处于重要位置的PKC［9，10］ ，是一类胞质内丝/苏氨酸蛋白激酶，广泛参与细胞的多种生命过程，包括生长、分化、细胞周期调节、肿瘤发生、细胞凋亡、T细胞的免疫过程以及学习和记忆等.其介导的信号转导通路可看作是不同于MAPK信号途径的另一信号转导通路，已有的资料表明，PKC可与Btk的PH结构域结合，且PKC对Btk的活性具有下调作用［7］ .但研究却发现PKC也对Ras有激活作用［5］ .与GRF及SOS-1相比，在体外PKC对Ras的激活方式以及激活后的效应可能会不同［6］ .我们的研究表明，PKC可与GRF的PH结构域结合，如果二者在体内能结合，在对Ras的激活过程中，PKC和GRF可以二聚体的形式发挥作用.由于GRF的PH结构域对PKC的活性具有下调作用，那么二者在对Ras激活时可能会存在相互调节效应.有关二者在体内的相互作用有待进一步研究.
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