【摘要】 目的 探讨丙戊酸(vpa）对卵巢癌裸鼠移植瘤血管形成的影响。方法 建立人卵巢癌裸鼠皮下转移瘤模型，将24只裸小鼠随机分为对照组、vpa组、顺铂（ddp）组、vpa+ddp 4组，每组6只。观察并记录各组裸鼠及其皮下移植瘤的生长情况，绘制肿瘤生长曲线、计算肿瘤体积、肿瘤生长抑制率。采用免疫组化sp法检测各组裸鼠皮下移植瘤中cd105 和sflk1的表达水平。结果 ① 治疗组裸鼠移植瘤的体积较对照组明显变小；② 各治疗组肿瘤组织的cd105表达较对照组均明显下降(p＜0.05)，sflk1表达较对照组均明显增高(p＜0.05)。结论 vpa对卵巢癌裸鼠移植瘤有明显抑制作用，其作用机理可能与抑制肿瘤血管形成有关，与ddp联合应用其抑瘤作用增强。
【关键词】 丙戊酸 顺铂 卵巢肿瘤 小鼠 裸
yang gaoyuan, rong fengnian, zhou ting
( department of gynecology and obstetrics, shandong qianfoshan hospital, school of clinical medicine, shandong university, jinan 250014, china)
to investigate the inhibitory effect of valproic acid（vpa）on angiogenesis of human ovarian cancer in nude mice. methods human ovarian cancer models were established by subcutaneous transplantation in nude mice, and then they were divided into 4 groups: the control group, the vpa group, the cisplatin (ddp) group and the vpa+ddp group. the antitumor efficacy was evaluated by determination of tumor volume, tumor growth and relative tumor curative rate. also expression levels of cd105 and sflk1 were determined by immunocytochemistry (ic). results ① tumor volumes in the experimental groups were smaller than those in the control group; ② expression levels of cd105 in the experimental groups were significantly higher than those in the control group(p＜0.05); and ③ expression levels of sflk1 in the experimental groups were significantly higher than those in the control group(p＜0.05). conclusions vpa can inhibit the growth of ovarian cancer by decreasing the expression of cd105 and increasing the expression of sflk1 levels.
key words： valproic acid； cisplatin； ovarian neoplasms； nude mice
卵巢癌是女性生殖器官的三大恶性肿瘤之一，且早期不易发现，多数患者确诊时已属晚期，因此卵巢癌的预后与化疗关系密切。Www.133229.Com丙戊酸(valproic acid，vpa)是临床上广泛使用的广谱抗癫痫药，具有抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，hdac）的作用，能抑制肿瘤血管的形成。vpa因生物利用度较好、毒副作用较低而备受关注［1］。本研究选用人卵巢癌移植瘤裸鼠作模型，观察vpa对肿瘤血管形成的抑制作用，初步探讨其相关机理
1 材料与方法
1.1 材料 人卵巢上皮腺癌skov3细胞，由山东大学齐鲁医院中心实验室提供；vpa纯品购自sigma公司；顺铂（cisplatin,ddp）纯品购自山东齐鲁制药厂（批号：7020111dc）；balb/c、 nu/nu裸小鼠24只，4～6周龄，雌性，体质量18～20ｇ，购自中国医学科学院实验动物中心，无特定病原体(specific pathogen free，spe)条件下饲养；鼠抗人cd105单克隆抗体、sflk1单克隆抗体，链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶免疫组化超敏试剂盒均购于北京中杉生物技术有限公司。
1.2 动物实验 制备卵巢癌细胞株skov3单细胞悬液，将细胞浓度为1×107/ml的单细胞悬液接种于实验裸鼠右侧腋窝皮下，0.2ml/只，含细胞数2×106/只。1周后出现2mm大的皮下移植瘤后开始治疗实验，将24只裸鼠随机分为4组，每组6只。（1） 对照组：每日向腹腔内注射生理盐水0.2ml；（2） 治疗组包括 ① vpa组：每日向腹腔内注射vpa，剂量为500mg/kg［1］，1次注射量为0.2ml，连续治疗4周；② ddp组：腹腔内注射ddp，剂量为3mg/kg，每6d注射1次，共5次； ③ vpa+ddp组：每日向腹腔内注射vpa，剂量为500mg/kg，连续治疗4周，在vpa治疗第1、4、8、12天分别注射ddp，剂量为3mg/kg，均于vpa注射6h后注射，1次注射量为0.2ml。vpa和ddp均溶于生理盐水中。
1.3 生长检测 每天观察裸鼠的饮食及活动状况；每周用精密电子天平测量裸鼠体重，进行药物毒性评价，即末质量（fbw）/初质量（ibm）≥0.8为无毒性反应；＜0.8为有毒性反应。接种后每天观察肿瘤的生长情况及有无红肿、破溃。成瘤后，检查移植瘤的表面形态及活动度，每2～3d用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径(a) 及最短径(b) ,根据公式v（mm3）＝0.5236ab2计算肿瘤体积，求其平均值，绘制肿瘤生长曲线并计算抑瘤率(inhibition rate)， 抑瘤率＝(对照组平均体积-治疗组平均体积) /对照组平均体积×100%。
1.4 cd105、sflk1的测定 各组于治疗结束6h内，用颈椎脱位法处死裸鼠，取肿瘤以10％福尔马林固定、石蜡包埋切片。分别行苏木精伊红(he)染色、cd105和sflk1 免疫组化染色及磷酸盐缓冲液(0.01mol/l,ph 7.4)替代一抗空白对照。免疫组织化学采用sp法，实验步骤按试剂盒说明书进行。抗原修复采用高温高压法。
1.5 结果判断 采用leica qwinv3图像分析软件对切片进行灰度分析。
1.6 统计学处理 采用sas6.12统计学软件进行单因素方差分析，所有数据均采用±s表示，p＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的成瘤及生长情况 见图1。24只裸鼠接种肿瘤成功率为100%,潜伏期约6～8d，肿瘤于局部呈膨胀性生长，2～3周后体积逐渐增大。实验结束时裸鼠均成活。治疗组肿瘤体积较对照组小，随治疗时间延长这种抑制作用更明显，见表1。
3 讨 论
肿瘤的生长和转移是一个依赖于血管形成的过程，当肿瘤体积大于2mm3时，维持其继续生长就需要新生血管的形成［2］。研究表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor,hdaci)具有广泛的抗肿瘤效应［3］。vpa作为hdaci家族种的一员近年来其潜在的抗肿瘤作用受到极大关注。资料表明vpa可阻断肿瘤血管生成［4］。本研究以上皮性卵巢癌细胞skov3裸鼠皮下移植瘤为研究对象，探讨了vpa、ddp及两者联合使用对卵巢癌裸鼠移植瘤生长的影响。肿瘤生长曲线及抑瘤率表明，各治疗组的肿瘤生长均受到一定程度的抑制，vpa与ddp联合应用对卵巢癌的生长抑制作用较为理想。
cd105作为转化生长因子β受体复合物（tgfβ）的组成成分之一［5］，可抑制tgfβ的生物学效应，此外，研究发现cd105还参与no合酶依赖的血管新生［6］。本实验中cd105在对照组高表达，在vpa组表达降低，vpa+ddp组中的表达明显降低。推测vpa可能通过降低cd105的表达，提高tgfβ1对内皮细胞增殖与迁移的抑制作用来抑制肿瘤血管的形成，从而进一步抑制肿瘤的生长。当vpa与ddp联合应用时，其抑瘤作用增强。
sflk1是可溶性血管内皮生长因子(vegf)受体2，其功能与vegf有关［7］。vegf可诱导内皮细胞增殖和肿瘤生长，sflk1和vgef结合后影响vegf胞内段的信号传导，导致血管内皮细胞的分裂及增殖能力降低，从而抑制肿瘤的生长［8］。本研究显示对照组中sflk1的表达明显降低， vpa组中sflk1的表达增强，vpa+ddp组中sflk1则显著升高。vpa可能通过上调sflk1的表达，抑制肿瘤血管内皮细胞的分裂和增殖，进而抑制肿瘤的生长，并且与ddp有协同作用。
【参考文献】
［1］ qiwei y, yufeng t, shuqing l, et al. thrombospondin1 peptide abt510 combined with valproic acid is an effective antiangiogenesis strategy in neuroblastoma［j］. cancer res, 2007, 67(4)：17161724.
［2］ 赵珊,荣风年,周婷.丙戊酸对人卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用［j］.山东大学学报：医学版,2007,45(3):306309.
［3］ 金顺安,刘宁,殷建军.cd105与cd34标记的mvd在乳腺癌中的表达及意义［j］. 中国妇幼保健,2007,22(33):47574758.
［4］ kaiser m, zavrski i, sterz j, et al. the effects of the histone deacetylase inhibitor valproic acid on cell cycle, growth suppression and apoptosis in multiple myeloma［j］. haematologica, 2006, 91(2):248251.
［5］ yasser e, jan s, peter o, et al. endoglin (cd105) and vascular endothelial growth factor as prognostic markers in prostatic adenocarcinoma［j］. am j clin pathol, 2007, 127(4):572579.
［6］ shivalingappa v, mourad t, chun l, et al. soluble endoglin contributes to the pathogenesis of preeclampsia［j］. nature med, 2006, 6(12):642649.
［7］ wang s, liu h, ren l, et al. inhibiting colorectal carcinoma growth and metastasis by blocking the expression of vegf using rna interference［j］. neoplasma, 2008, 10(4):399407.
［8］ ebos j, lee c, christensen j, et al. multiple circulating proangiogenic factors induced by sunitinib malate are tumorindependent and correlate with antitumor efficacy［j］. proc natl acad sci u s a, 2007, 104(43):1706917074.
