体外研究论文

国际会议特邀报告：1. 2009年8月，第7届中日韩反刍动物瘤胃生理与调控学术研讨会Keynote speech，韩国，首尔。2. 2008年9月，第13届亚澳动物科学代表大会 (13th AAAP Animal Science Congress)作动物营养专题报告（invited paper），越南，河内。3. 2007年9月，第七届国际草食动物营养研讨会，大会特邀报告(plenary paper)，北京；发表的主要论文 (* 为通讯作者)1) Dai ZL, Zhang J, Wu G, Zhu W-Y*, 2010. Utilization of amino acids by bacteria from the pig small intestine. Amino Acids, 39 (5): ) Huang RH, Qiu XS, Shi FX, Hughes CL, Lu ZF, Zhu W Y*. 2010. Effects of dietary allicin on health and growth performance of weanling piglets and reduction in attractiveness of faeces to flies. Animal, (first view)3) Pei CX, Mao SY, Cheng YF, Zhu W-Y*, 2010. Diversity, abundance and novel 16S rRNA gene sequences of methanogens in rumen liquid, solid and epithelium fractions of Jinnan cattle. Animal, 4(1):20–294) Sun YZ, Mao SY, Zhu W-Y*. 2010. Rumen chemical and bacterial changes during stepwise adaptation to a high concentrate diet in goats. Animal, 4(2):210–2175) Cheng Y F, Edwards J E., Allison G G., Zhu W-Y* and Theodorou M K., 2009. Diversity and activity of enriched ruminal cultures of anaerobic fungi and methanogens grown together in consecutive batch culture. Bioresource Technology, 100 (2009) 4821–) Lu Y, Sarson AJ, Gong J, Zhou H, Zhu W-Y, Kang Z, Yu H, Sharif S, Han Y. Expression profiles of genes in Toll-like receptor-mediated signaling of broilers infected with Clostridium perfringens. Clinical and Vaccine Immunology, 2009, 16(11):) Iqbal MF, Zhu W-Y*, 2009. Characterization of newly isolated Lactobacillus delbrueckii –like strain MF-07 isolated from chicken and its role in isoflavone biotransformation. FEMS Microbiology Letters, 291 (2): 180-187, FEB 20098) Iqbal MF, Zhu W-Y*, 2009. Bioactivation of flavonoid diglycosides by chicken cecal bacteria. FEMS Microbiology Letters, 2009, 295, ) Cheng YF, Mao SY, Liu JX, Zhu WY*, 2009. Molecular diversity analysis of rumen methanogenic Archaea from goat in eastern China by DGGE methods using different primer pairs. Letters in Applied Microbiology, 2009, 48(5):) Zhou, W, Wang, GJ, Han, ZK, Yao, W, Zhu, WY. 2009. Metabolism of flaxseed lignans in the rumen and its impact on ruminal metabolism and flora. Animal Feed Science and Technology, 150 (1-2): ) Zhou, W, Han, ZK, Zhu, WY, 2009. The metabolism of linseed lignans in rumen and its impact on ruminal metabolism in male goats. Journal of Animal and Feed Science, 18 (1): 51-60 200912) Su Y, Yao W, Perez O, Smidt H, Zhu W-Y*, 2008. Changes in abundance of Lactobacillus spp. and Streptococcus suis in stomach, jejunum and ileum of piglets after weaning. FEMS Microbiology Ecology, 66:) Yu ZT, Yao W, Zhu WY*, 2008. Isolation and identification of equol-producing bacterial strains from cultures of pig faeces. FEMS Microbiol Lett 2008, 282:73–) Su Y, Yao W, Perez-Gutierrez ON, Smidt H, Zhu WY*.2008. 16S ribosomal RNA-based methods to monitor changes in the hindgut bacterial community of piglets after oral administration of Lactobacillus sobrius S1. Anaerobe, 14(2): ) Mao SY, Zhang G, Zhu WY*, 2008. Effect of disodium fumarate on ruminal metabolism and rumen bacterial communities in goat as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16S ribosomal DNA. Animal Feed Science and Technology, 140 (2008) 293–) Mao SY, Zhang G, Zhu WY*, 2008. Effect of disodium fumarate on ruminal metabolism and rumen bacterial communities in goat as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16S ribosomal DNA. Animal Feed Science and Technology, 2008, 140: 293–) Iqbal MF, Cheng YF, Zhu WY*, Zeshan B, 2008. Mitigation of ruminant methane production: current strategies, constraints and future options. World J Microbiol Biotechnol, 24:) Sun YZ, Mao SY, Yao W, Zhu WY*. 2008. DGGE and 16S rDNA analysis reveals a highly diverse and rapidly colonising bacterial community on different substrates in the rumen of goats. Animal, 2008, 2 (3): 391–39819) Guo, YQ, Liu, JX, Lu, Y, Zhu, WY, Denman, SE, McSweeney, CS, 2008. Effect of tea saponin on methanogenesis, microbial community structure and expression of mcrA gene, in cultures of rumen micro-organisms. Letters in Applied Microbiology, 47(5):) Zhang, CM, Guo, YQ, Yuan, ZP, Wu, YM, Wang, JK, Liu, JX, Zhu, WY. 2008. Effect of octadeca carbon fatty acids on microbial fermentation, methanogenesis and microbial flora in vitro. Animal Feed Science and Technology, 146(3-4):) Mao SY, Zhu WY*, Wang QJ, Yao W. 2007, Effect of daidzein on in vitro fermentation of micro-organisms from the goat rumen. Animal Feed Science and Technology, 136：) Mao SY, Zhang G, Zhu WY*, 2007, Effect of disodium fumarate on in vitro rumen fermentation of different substrates and rumen bacterial communities as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16S ribosomal DNA. Asia-Australian Journal of Animal Sciences, 20 (4): ) Liu W, Mao SY, Zhu WY*, 2007. Impact of tiny miRNAs on cancers. World Journal of Gastroenterology, 13(4):) Yu QH, Dong SM, Zhu WY, Yang Q, 2007. Use of green fluorescent protein to monitor Lactobacillus in the gastro-intestinal tract of chicken. FEMS Microbiology Letters, 275 (2): ) Wang HF, Zhu WY, Yao W, Liu JX, 2007. DGGE and 16S rDNA sequencing analysis of bacterial communities in colon content and feces of pigs fed whole crop rice. Anaerobe 13: ) Li MY, Zhou GH, Xu XL, Li CB, Zhu WY. Changes of bacterial diversity and main flora in chilled pork during storage using PCR-DGGE. Food Microbiology, 2006, 23: ) Zhu WY*, Mao SY, Liu JX, Cheng YF, Iqbal MF, Wang JK, 2007. Diversity of methanogens and their interactions with other microorganisms in methanogenesis in the rumen. Plenary Paper, Proceedings of the 7th International Symposium on the Nutrition of Herbivores, pp 125-139, Beijing, September 17 – 22, ) Zhu WY*, Iqbal M F, Cheng YF, Liu JX, Mao SY, 2008. Rumen methanogenesis and nutritional approaches to the mitigation of ruminant methane. Invited paper, The 13th Animal Science Congress of the Asian – Australasian Association of Animal Production Societies, International Symposium: ”Recent Advances in Ruminant Nutrition”, pp 33-40, 2008/9/2229) Zhu WY*, Mao SY, Cheng YF, Liu JX, Wang JK, 2009. Rumen microbial communities involved in methanogenesis and nutritional strategies to mitigate. Invited Keynote Speech: The 7th Korea-Japan-China Joint symposium on Rumen Metabolism and Physiology, 2009/8/) Han ZK, Wang GJ, Yao W, Zhu WY*. 2006. Isoflavonic phytoestrogens - new prebiotics for farm animals: a review on research in China. Current Issues in Intestinal Microbiology, 7:) 毛胜勇，王新峰，朱伟云，2010. 体外法研究延胡索酸二钠对瘤胃微生物发酵活力及甲烷产量的影响。草业学报，19（2）：69-75。32) 毛胜勇，龙黎明，朱伟云，2010. 体外研究反刍兽新月形单胞菌及与酵母联用对瘤胃微生物发酵的影响。草业学报，19（8）：176-186。33) 陆扬，姚文，苏勇，朱伟云*, 2010. 大豆苷元对断奶仔猪胃肠道发育的影响. 南京农业大学学报，33(2):) 成艳芬，朱伟云*，2009. ARISA方法研究产甲烷菌共存及去除条件下瘤胃真菌多样性变化。微生物学报，2009， 49（4）：) 杭苏琴，戴兆来，朱伟云*，2009，甘露寡糖对纯培养和共培养的乳酸杆菌体外生长的影响。微生物学通报，2009，36（1）：) 于卓腾，姚文，朱伟云*，2009，体外培养发现二花脸猪粪样菌群具有降解大豆黄酮产生雌马酚的能力。南京农业大学学报，2009，32（1）：164-167。37) 刘相玉，毛胜勇，朱伟云*，2009，高精料日粮条件下酵母培养物对瘤胃细菌体外发酵的影响。动物营养学报，2009，21（2）：) 龙黎明，毛胜勇，苏勇，朱伟云，一株瘤胃源乳酸利用菌的分离鉴定及其体外代谢特性研究。微生物学报，2008，48（12）：1571-1577。39) 苏勇，姚文，朱伟云*，代表性差异分析比较两株来自不同地区的猪源Lactobacillus 菌株。微生物学报，2008，48(5)：1~6。40) 戴兆来，董红军，林勇，黄瑞华，朱伟云*，合生元组合筛选及对仔猪生产性能和腹泻的影响。南京农业大学学报，2008，31（2）：81-85。41) 裴彩霞， 毛胜勇， 朱伟云*，晋南牛瘤胃中古菌分子多样性的研究。微生物学报，2008，48（1）：8-14。42) 俞晓辉，姚文，施学仕，朱伟云，大豆发酵蛋白替代鱼粉对断奶仔猪生产性能和肠道主要菌群的影响。动物营养学报，2008，20（1）：46-51。43) 罗玉衡，朱伟云*，2007，消化道微生物区系与肥胖关系的研究进展。微生物学报，47（6）：1115-1118。44) 刘威，朱伟云*，姚文，毛胜勇，2007，一株乳酸利用、丁酸产生菌的分离与鉴定及代谢特性的初步研究。微生物学报，47（3）：435-440。45) 张耿，朱伟云*，刘相玉，毛胜勇，2007，延胡索酸二钠对瘤胃微生物体外发酵不同饲料成分的影响。草业学报，16：112-117。46) 于卓腾 姚 文 毛胜勇 朱伟云*，2007，黄豆苷元对仔猪肠道微生物区系的影响。营养学报，29（1）：82-86。47) 姚光国，姚文，陆扬，朱伟云*，2007，乳酸菌肽聚糖部分免疫增强作用的研究。微生物学通报，34（1）：105-107。48) 成艳芬，毛胜勇，裴彩霞，刘建新，朱伟云*，共存于厌氧真菌分离培养液中瘤胃甲烷菌的检测及其多样性分析。微生物学报，2006，46（6）：879-883。49) 孙云章，毛胜勇，姚文，朱伟云*，2006，不同精粗比底物下瘤胃真菌和纤维降解细菌共培养发酵特性及菌群变化。微生物学报，46（3）：422-426。50) 姚文，朱伟云*, 毛胜勇，2006，16S rDNA技术跟踪分析新生腹泻仔猪粪样细菌区系的变化。微生物学报，45（1）：150-154。专利等成果1. 发明专利：一种芽孢乳杆菌及其生产的活菌制剂。（授权公开日：2007年6月20日）；2. 国家发明专利受理一项：绞股蓝皂甙用于减少动物瘤胃内甲烷产生的方法。3. 成果鉴定：仔猪肠道微生物区系研究及芽孢乳杆菌S1研制。苏科鉴字【2004】第1308号。鉴定形式：会议鉴定。组织鉴定单位：江苏省科技厅。鉴定日期：2005年1月29日。

中药是中华民族的伟大瑰宝，有着丰富的资源和悠久的传承历史，历经了千百年的临床实践，虽然积累了丰富的临床经验，为中华民族的健康事业作出巨大的贡献。但是中药的研发仍然充满了挑战，如药材来源变异大、有效成分不明、质量控制困难、缺乏清晰准确的安全性评价、药理作用机制不明等等。因此，至今还没有一种中药通过美国FDA的新药审批；而且，欧盟已经颁发了(欧盟传统药品法案)，也直接影响了中药的出口。为了扭转目前这种尴尬的境地，实现真正与国际接轨。发展祖国中医药事业，必须对中药的安全性、作用机理及其药理活性成分有明确的认识，并深入剖析。近十多年来。在西方药物发现和开发阶段利用体外和计算机辅助研究技术进行化合物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性(ADME／T)特性研究，大大提高了新药研发的成功率【1]。所以借鉴西方新药研发的成功经验，将ADME／T评价体系引入到中药的研究中。特别是药物代谢研究，不仅有利于揭示中药的真正有效成分和作用机理，而且有利于研究中药复方的配伍规律等。本文将综述药物代谢(Dmg Metabolism)在中药研究中的应用概况及其进展。1 药物的代谢药物在机体内的消除方式主要有两种：一种是药物不经任何代谢而直接以原型随粪便和尿液排出体外；另一种是部分药物在体内经代谢后，再以原型和代谢物的形式随粪便和尿液排出体外。药物的代谢(drug metabolism)也称为药物生物转化(biotransformation)，是药物从体内消除的主要方式之一【2J。药物在体内的代谢主要分为两个步骤【3j，第一步称为I相代谢反应。药物在I相反应中被氧化、还原或水解，催化I相代谢反应的酶主要为肝微粒体中的细胞色素P450酶。第二步称为Ⅱ相结合反应。药物在Ⅱ相结合反应中与一些内源性的物质(如葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽等)结合或经甲基化、乙酰化后排出体外。催化Ⅱ相结合反应的酶主要有葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽一s一转移酶、磺基转移酶和乙酰基转移酶等【4 】。其中P450酶在众多外来化合物的生物转化过程中扮演了重要角色，被P450酶催化的底物相当广泛，90％以上药物的氧化是由P450酶催化的。是人体内最重要的代谢酶，其催化的I相代谢反应是化合物在体内代谢的关键步骤。因为这一步反应通常是药物从体内清除的限速步骤，可影响化合物的半衰期、清除率等动力学特性，且P450酶活性常常随遗传因素、年龄、疾病状态或其他药物相互作用的影响而发生改变L7J。一般来说，药物在体内经过代谢转化后其药理活性发生了较为复杂的变化，大致分为四种情况：第一，代谢物活性或毒性降低；第二，形成活性代谢物；第三，形成毒性代谢物；第四，前药的代谢激活。总之，药物代谢转化的最终结果是使药物极性增加。有利于药物的排出体外【2．3】。2 药物代谢研究的方法药物代谢的研究方法分为体内法和体外法，两者各有优缺点，所以通常两者相结合进行药物的评价研究。体外研究可以通过高通量筛选对大量化合物进行筛选，对大量候选化合物的药动学特性作出初步的评价。缩小体内筛选的范围，一般应用于药物发现和开发的初期。体内代谢研究是体外研究的良好的衔接点，因为有时候应用体外模型预测体内参数不理想，必须借助体内筛选。当然在药物开发的后期，也要进行动物和人体体内药物代谢研究，总之，两者相辅相成【3J。2．1 体内法药物的体内代谢研究主要是在整体水平上进行的。给予一定剂量的药物后，于不同的时间段分别收集胆汁、尿液和粪便，然后用高效液相色谱法(HPLC)或液质联用技术(LC-MS／MS)等方法在胆汁、尿液和粪便样品中寻找药物的代谢物(包括I相和Ⅱ相代谢物)。并对代谢产物进行初步的分析和鉴定，最终确定药物在体内的代谢途径。2．2 体外法肝脏是药物代谢的主要和重要器官之一，是药物生物转化的主要场所，因为富含有丰富的肝药酶，所以大部分的药物在肝脏被代谢。故药物的体外代谢模型多以肝脏为基础。常见的有：肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流法、肝切片法和重组I)450酶体外温孵法等。药物体外代谢研究中应用到的方法除了高效液相色谱法(HPLC)或液质联用技术(LCMS／Ms)，还有分子生物学的方法，如we．ston bloting等。体外法因有其独特的快速简便和节约成本等优势和特点。所以在药物代谢研究中得到了广泛的应用。除了肝脏以外，口服药物还必须经过胃肠道消化吸收后才能进入血液发挥疗效(如人参皂苷的体内代谢[8 )，因此药物在胃肠内菌群的代谢越来越受到人们的重视，而且已经有人把药物在肠内菌代谢的研究引入到药物代谢的研究范畴。其常见的研究方法也有整体肠内菌代谢实验和离体实验两种，前者是对人或动物服药后的消化道各部分及其内容物进行分析，后者有粪便温孵法和消化道内容物温孵法，随着微生物技术的发展，也可用肠内菌纯菌株、混合菌或粗酶进行代谢研究。3 药物代谢在中药研究中的应用3．1 中药代谢产物谱的定性研究要了解中药在体内的代谢转化规律，首先应该明白其在体内转化成什么产物，而且这些产物有可能是活性增强的产物或活性减弱的产物。也有可能是毒性成分。因此对代谢产物谱的研究显得特别重要，它不仅可以阐明其在体内的代谢途径和机制，也可以进行代谢产物的有效性和安全性评价。国内对这一方面的研究报道较多，一般是将中药代谢后的各种生物样品采用各种手段分离后进行分析鉴定。如阿基业等人给予大鼠一定剂量的盐酸关附甲素后，在不同时间间隔收集大鼠尿液，应用液质联用法进行分析鉴定。结果表明关附甲素在大鼠体内可以转化成为关附壬索、关附醇胺、关附甲素葡萄糖醛酸和硫酸结合物、关附壬索葡萄糖醛酸和硫酸结合物，经过生物转化，代谢产物的极性增加，药效下降【9j。李晓海等人采用大鼠肝微粒体体外温孵法和大鼠体内法对左旋一叶蔌碱的代谢转化进行了研究，代谢产物分别鉴定为6一位羟基、6．位羰基及5一位a及B羟基取代的左旋一叶蔌碱，还证实了体内6一位羟基代谢物进一步形成了Ⅱ相结合物。最终基本阐明左旋一叶蔌碱在大鼠体内外代谢转化的途径Cio】。徐文等人将待测淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ与新鲜配制的大鼠肠内溶物悬液在37℃孵化，采用高效液相色谱同时测定孵化前后溶液中淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的浓度，结果表明淫羊藿苷被肠道菌群迅速代谢成淫羊藿次苷Ⅱ，而淫羊藿次苷Ⅱ不被代谢[11]。3．2 中药代谢酶谱的研究鉴定参与中药代谢的代谢酶种类及其贡献，对中药现代化的研究同样重要。因为遗传因索和环境因素造成人体对药物代谢的存在差异，这种差异表现为代谢酶的表达差异，其根本原因是代谢酶的基因多态性决定的，依此可将人群分为强、中和弱代谢型等表型C12J。强代谢者和弱代谢者之间药代动力学性质存在显著差异[13J，因此给予不同代谢表型人群相同的剂量，药物产生的疗效会完全不一样。甚至会中毒现象的发生【l 。所以鉴定参与中药代谢的代谢酶种类及其贡献有利于指导临床合理用药，保证用药安全有效。此外中药代谢酶谱的研究还有利于研究中药的配伍规律、中药毒性研究等。高凯等人采用大鼠肝微粒体体外温孵法和高效液相色谱技术，通过运用不同的CYP同工酶选择性抑制剂和底物进行抑制实验，初步选出介导甘草次酸单羟化所涉及的CYP同工酶为CYP 3A1／2和CYP 2C9／10 cis}，研究结果提示当甘草次酸在CYP 3A1／2和CYP 2C9／lO弱表达的代谢者人群中使用时，应该注意剂量的控制，否则可能会出现中药的安全性问题。3．3 中药对代谢酶的诱导或抑制以及药物间相互作用研究中药的化学成分非常复杂。许多中药有效成分对CYP450酶表现出明显的诱导或抑制。如中药白芷中富含呋哺香豆素化合物，研究发现白芷提取物可以抑制大鼠肝微粒体CYP 3A、CYP 2C和CYP 2D1的活性，所以会抑制甲苯磺丁脲、地西泮、硝苯地平等在体内的代谢[16]。中药黄芩的主要有效成分黄芩苷。对 1Al、CYP 2B1和CYP 2Cll这3种同工酶有明显的诱导作用【l 。中药在lJ笛床上常复方用药或与化合物合并用药。这就有可能发生药物间的相互作用，引起药效、药动学、毒性等的变化。药物间的相互作用主要表现为药物代谢酶的诱导或抑制。如人参的有效成分人参皂苷Rd，它对CYP3A4有抑制作用；而人参再造丸、通心络等中成药组方中又含有人参，因此如果患者在服用通心络、人参再造丸等中成药时，同时服用经CYP3A4代谢的化学药硝苯地平、胺碘酮等，就可能会导致低血压等不良反应[18]。高月等人考察中药丹参、苦参、人参及其与藜芦合用对大鼠肝P450酶活力及mRNA表达的影响，结果显示这3种中药与藜芦配伍合用后均不同程度的抑制了P450酶含量和主要的药物代谢酶CYP3A及CYP2E1的酶活力。提示可能正是由于3种中药与藜芦配伍后对药物代谢酶的抑制作用减缓了剧毒中药藜芦中相关物质的代谢．致毒性增加，产生了不期望的中药毒性【l 。4 展望随着科学技术的发展，中药代谢的研究除了深入研究单一成分的代谢外。首先应加强有效部位、单味药材和中药复方的代谢研究，这样才能更准确更全面的阐明中药的药效作用机制；其次，应该深入开展中药基于代谢酶的配伍规律的研究，阐明中药复方中各单味药材之间的相互关系以及中药复方的解毒机制。总之，随着中药代谢的深入研究，以及其他学科和技术的合作。必将揭示中药的代谢规律、中药的配伍规律和解毒机制等，为中药新药的研制、创新药物的发现以及指导临床用药作出贡献。