微生物学报告

食品微生物学检验 菌落总数测定 1 范围 本标准规定了食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测定方法。 本标准适用于食品中菌落总数的测定。 2 术语和定义 菌落总数 aerobic plate count 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。 冰箱：2 ℃～5 ℃。 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 天平：感量为 g。 均质器。 振荡器。 无菌吸管：1 mL（具 mL 刻度）、10 mL（具 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。 无菌培养皿：直径90 mm。 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 放大镜或/和菌落计数器。 4 培养基和试剂 平板计数琼脂培养基：见附录A 中。 磷酸盐缓冲液：见附录A 中。 无菌生理盐水：见附录A 中。 5 检验程序 菌落总数的检验程序见图1。图 1 菌落总数的检验程序 6 操作步骤 样品的稀释 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 按 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 培养 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。水产品30 ℃±1 ℃培养72 h±3 h。 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按 条件进行培养。 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。 选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌

革兰染色法\x0d\x0a【步骤】：制片、染色、镜检\x0d\x0a1、制片\x0d\x0a涂片 ：取洁净载玻片一张，用接种环取生理盐水2环，置于玻片上，接种环灭菌后，取细菌培养物少许与盐水混匀，并涂成均匀薄膜涂片。如用液体材料，如痰、尿液、脓汁等可直接涂片，不必加生理盐水。\x0d\x0a干燥 ：涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将标本面向上，小心间断地在弱火高处烘干，但切勿紧靠火焰将涂膜烤枯。\x0d\x0a固定：涂片干燥后，将标本片在酒精灯上快速的来回通过三次，共约2s～3s，注意温度不可太高，以涂片涂膜的反面触及皮肤觉轻微烫觉即可。\x0d\x0a固定目的：①杀死细菌；②使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；③菌体蛋白变性易着色。\x0d\x0a2、染色\x0d\x0a结晶紫初染 1 min → 卢戈氏碘液媒染 1 min → 95％酒精脱色 30sec～1 min → 稀释石炭酸复红复染 1 min，油镜观察\x0d\x0a【原理】：\x0d\x0a①革兰阳性细菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入。 \x0d\x0a②革兰阳性菌的等电点低，革兰阴性菌的等电点较高，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固不易脱色。 \x0d\x0a③革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。\x0d\x0a【结果观察】：紫色为阳性，红色为阴性\x0d\x0a【影响因素】\x0d\x0a①操作因素：涂片太薄或太厚，固定时菌体过分受热，以及脱色时间长短，都会影响染色结果\x0d\x0a②染液因素：所有染液应防止染液蒸发而改变浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用；涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果\x0d\x0a【意义】：\x0d\x0a①鉴定细菌：可将细菌分为革兰阳性菌（紫色）和革兰阴性菌（红色），\x0d\x0a②观察致病性：大多数G+菌以外毒素为主要致病物质，而G- 菌以内毒素为主要致病物质。两者的致病机制和临床表现各不相同，\x0d\x0a③参考选择抗菌药物：大多数G+菌对青霉素、头孢菌素等敏感；大多数G- 菌对氨基苷类抗生素如链霉素、庆大霉素等敏感。\x0d\x0a【用途】：一般细菌学检查或鉴定\x0d\x0a\x0d\x0a我这个比较简单概括，你最好详细化，比如染色步骤