流式细胞术论文参考文献

前言

细胞凋亡通常称为细胞程序性死亡，是由基因控制的主动性细胞死亡过程。越来越多数据发现，细胞凋亡与多种疾病密切相关，如癌细胞具有连续增殖、抵抗细胞凋亡能力，利用流式细胞仪分析细胞凋亡可为肿瘤诊断，疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。然而很多实验的同学们，常会碰到上机检测时细胞死亡太多却检测不出凋亡，多次重复结果不一致等现象，本文就一起看看如何把细胞凋亡的数据变的更加漂亮，准确！

首先，明确一下细胞凋亡和坏死的区别

细胞凋亡(apoptosis) 是一件主动性细胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控，是细胞为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。 具体表现为： 出芽形成凋亡小体、核小体间DNA的切割，凋亡小体被吞噬和消化等几个连续过程等[1]（如下图所示）。

图1：细胞凋亡的发生过程[1]

细胞坏死（necrosis） 则是一件被动的过程，是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，即病理条件下，自体损伤的一种现象。 具体表现为： 细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，会引起局部严重的炎症反应（如下图所示）。

图2：细胞坏死的发生过程[1]

一、流式检测细胞凋亡的原理

Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法 ，它是基于凋亡的早期细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine, PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面这一原理来实现的（如下图3）。

图3：凋亡早期 PS从细胞膜的内侧外翻

该方法简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，具体原理如下：

因此，将Annexin V与PI联合使用时，便可用来鉴别活细胞，凋亡细胞及死亡细胞。

二、实验操作步骤

三、数据分析

Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针，FITC最大激发波长为488 nm，最大发射波长525 nm，FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm，PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。通过软件分析，绘制双色散点图，FITC为横坐标，PI为纵坐标。

如下图所示：细胞可以分为4个象限：

图4：4个象限的细胞分布图

举例：如常用于研究药物或者基因等对细胞凋亡的影响。 通过比较Control组和药物组，发现化合物可以诱导前列腺癌细胞系PC-3M的细胞凋亡，处理组（20μM）的晚期凋亡细胞比例与Control组（0μM）相比，从上升到。进而还可根据每个象限的数据计算出活细胞、凋亡细胞和坏死细胞百分率。

图5. 药物浓度梯度依赖性的诱导PC-3M细胞凋亡[2]

四、常见问题解答

1. 如何避免出现假阳性结果？

2. 为什么必须收集细胞上清？

因为凋亡的细胞可能会脱壁，悬浮于培养基，所以必须收集上清再离心取沉淀，合并胰酶消化下来的细胞，不然检测出来的凋亡比例可能会减少。

3. 为什么在染色后1h内就要上机检测？

由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析；PI受时间的影响很大，因标记了PI后会加大细胞毒性，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大，所以建议在一个小时内检测。

4. 其他注意事项

参考文献：

[1]Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007;35:495-516.

[2]Qin M, Peng S, Liu N, et al. LG308, a Novel Synthetic Compound with Antimicrotubule Activity in Prostate Cancer Cells, Exerts Effective Antitumor Activity.[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2015,355(3): 473-483.

与传统多色流式实验一样，质谱流式同样需要「烧脑」考虑配色（panel design），在实验前「步步精心」，正所谓一步错，步步错，策划周全的实验方案是获得有效数据的关键。下面就让我们一起揭秘质谱流式，文末更有CyTOF / Luminex 多重检测技术交流会，现场体会质谱流式的魅力。

了解更多质谱流式原理，请查看：质谱流式，一个富二代的自白

特色同位素标记

质谱流式相对于传统流式技术的主要差异在于使用金属元素及其同位素作为抗体标签，目前用作标签的主要有稀土元素、惰性元素、后过渡金属和卤素，这些元素在细胞内含量少，不会引起高背景，也不会影响细胞正常的生理功能，目前用作质谱流式标签的主要同位素如下图所示：

通过这些标签标记的抗体，可以检测细胞相关生物标志物的表达及修饰、细胞活性、细胞功能及细胞周期等。

相较传统流式而言，质谱流式技术中相邻通道的干扰已经降低了很多，然而溢漏现象依然存在，主要由以下几个原因导致：

①.同位素纯度不够（Impurities）。

②. M ± 1，是指相邻通道的溢漏，被称为丰度灵敏度（Abundance Sensitivity），简单说就是质量为M的峰的拖尾，在M + 1和M – 1质量上的信号干扰。

③. M + 16，是指同位素氧化导致的干扰（Oxidation）。如轻镧系元素（139～160 AMU）因为氧化物的形成，导致了对重镧系元素（155~176 AMU）通道产生干扰，目前通过实验体系的优化，最容易氧化的镧系元素同位素的干扰降低到以下。89Y,102Pd,104Pd,105Pd,106Pd,108Pd,110Pd,113In,115In,和209Bi同位素不会产生氧化干扰，也不会对轻、重镧系元素产生氧化干扰。

（A）质谱流式技术干扰信号源示意图[1]

Chevrier S 等使用单染微球计算出通道间溢漏的矩阵，可作为通道选择的参考，如图B 所示：

（B）基于单染微珠计算的溢漏矩阵。对角线上的值是1。默认情况下，溢漏只计算潜在受影响的通道，包括M ± 1，对应已知同位素纯度，M + 16。小格中的数字表示行中的元素溢漏到列中通道的百分比。最后一列中的数字表示在相应通道中接收到的溢漏信号总量。

Panel Design 基本策略

同传统流式一样，针对不同表达丰度的标志物，也遵循「强弱搭配」原则，即表达丰度高的标志物选择较低或中等灵敏度的同位素标签；表达丰度低的标志物选择高灵敏度的同位素标签。

表达丰度低或未知的抗原：

表达丰度高的抗原：

此外，还可以遵循以下规则：

①. 互斥抗原（如CD4 和CD8）可以安排在有干扰的通道。

②.共表达抗原（如CD3和CD4）安排在互不干扰的通道。如果无法避免，可以安排下级（如CD4）影响上级通道（如CD3）。

③.设置完善的对照。除实验必需对照外，可以设置Mass-minus-one (MMO) controls，类似传统流式的FMO（荧光减一对照），以此判断通道的干扰。

④.区分单细胞群和活细胞群。质谱流式仪无FSC / SSC参数来区分细胞，因此常使用铱（iridium）或铑（rhodium）的同位素作为核酸嵌入剂，根据DNA含量来识别整体细胞群、区分粘连体和碎片。化学治疗剂顺铂（铂）能够和有损伤的细胞膜共价结合，常被用来区分死活细胞。

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文章来源：Bio-Techne 图片来源：Bio-Techne、站酷海洛 题图来源：站酷海洛 Image byGerd AltmannfromPixabay