肝癌患者的毕业论文

【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 Effect of dendritic cells transfected with total RNA of HepG2 cell line using GFP marker in vitro 【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of GFP as a marker to observe the dendritic cells (DCs) transfected with total RNA of tumor cells and the feasibility of the transfected DCs serving as a vaccine for potential immunotherapy. METHODS: Plasmid pGFPC3 was transfected into HepG2 stably. Total RNA was extracted from the HepG2GFP using Trizol; DCs were induced by liver cancer patients peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and transfected with the total RNA. The effect of transfection was observed by a fluorescence microscope, the changes of phenotype were detected by flow cytometry, and the change of IL12 secretion in the supernatant of DCs was detected by ELISA assay. The cytotoxic effect of CTLs was assessed by MTT assay. RESULTS: GFP was expressed stably in the HepG2GFP cells that presented green fluorescence under a fluorescence microscope, so did DCs transfected with total HepG2GFP cell RNA. After transfection, the expression of membrane molecules such as CD80 ( to ), HLADR ( to ), CD83 ( to ), CD86 ( to ) was increased dramatically, IL12 secretion in the supernatant was elevated significantly 〔(±) ng/L to (±) ng/L, P＜〕. The CTLs activated by DCs transfected with total HepG2GFP RNA showed a potent specific lysis to HepG2 cells. CONCLUSION: GFP could be used as a marker to observe the effect of transfection of DCs with total tumor cell RNA. DCs transfected with total tumor cell RNA may serve as a promising vaccine of immunotherapy. 【Keywords】 dendritic cell；green fluorescent protein；RNA；transfection 【摘要】 目的：探讨GFP作为标记观察肝癌细胞RNA转染DCs效果的可行性及肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性. 方法：绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，Trizol法提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA；分离肝癌患者外周血单核细胞体外诱导DCs细胞，总RNA转染DCs，荧光显微镜下观察转染效果，流式细胞仪检测转染前后DCs表型变化；ELISA法检测转染前后上清中IL12变化情况；MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率. 结果：pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2后可得到稳定表达GFP的细胞HepG2GFP，荧光显微镜下呈绿色荧光；总RNA转染的DCs荧光显微镜下呈绿色荧光，CD80(上升至)，HLADR(上升至)，CD83(上升至)，CD86(上升至)表达明显升高，上清IL12分泌量ng/L显著增高(±→±，P＜)；诱导的CTL能够对肝癌细胞株HepG2起特异性杀伤作用. 结论：GFP可以作为肿瘤细胞RNA转染树突状细胞的观察标记，肿瘤细胞RNA转染DCs可作为一种有效的肿瘤疫苗. 【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 【中图号】 0引言 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见的恶性肿瘤，适合手术治疗的患者只占一少部分，具有较高的复发率，预后很差，严重威胁人类健康〔1〕. DCs(dendritic cells, DCs)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞，它能够高效的摄取、处理抗原，并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞，引起针对该抗原的特异性免疫反应〔2〕. 国内外类似的研究中，都没有明确的可以观察肿瘤RNA转染DCs效果的指标，我们应用绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA转染DCs，观察转染后DCs绿色荧光蛋白表达及特异性表面标志及功能相关分子表达，检测其上清细胞因子分泌，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性. 1材料和方法 材料肝癌患者外周血单个核细胞来源于我科造血干细胞移植患者；HepG2肝癌细胞株由我科常规传代培养. 流式细胞仪（BD），DG3022A型酶联免疫检测仪（华东电子管厂），荧光显微镜Optiphot XIF（Nicon）等均为我院常备. FITCCD80，FITCHLADR，PECD83，PECD86抗体购自BD公司；rhGMCSF，rhIL4购自Peprorotec公司；TNFα购自我校生物技术中心；绿色荧光蛋白载体pGFPC3由陕西省肿瘤医院贾军博士惠赠；脂质体Transfection2000，Trizol Reagent购自Invitrogen；RPMI 1640培养基、胎牛血清、G418购自Gibco公司，Xvivo无血清培养基购自BioWhittaker；IL12 ELISA检测试剂盒购自Bioscience公司；MTT购自Sigma公司. 方法参照Transfection2000说明书，pGFPC3转染HepG2，G418筛选2 mon. 筛选细胞命名HepG2GFP，荧光显微镜下观察. Trizol试剂提取HepG2GFP总RNA，紫外灯下观察，-80℃冻存备用. 同样方法提取HepG2总RNA. 取肝癌患者造血干细胞分离液，贴壁法分离单核细胞，贴壁细胞在细胞因子rhGMCSF，rhIL4作用下，诱导DCs. 倒置显微镜、电子显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型. 转染树突状细胞收集培养4 d的DCs，转入6孔板，转染HepG2GFP总RNA. 另设转染HepG2总RNA及空白对照组. 继续培养48 h. 荧光显微镜下观察. 细胞因子分泌的测定48 h后，收集各组DCs上清，ELISA法检测转染前后各组细胞上清中IL12分泌量. 效应收集各组DCs，30 Gy 60Co照射后与复苏冻存的非贴壁细胞按20∶1比例混合接种于24孔板，培养5 d，收集的细胞即为效应细胞. 收集对数生长期的HepG2细胞作为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按20∶1比例混合接种于96孔板. 同时设单一靶细胞组、单一效应细胞组. 培养24 h后，MTT法检测.以下述公式计算杀伤效率.CTL杀伤效率=〔1-（效靶A490-效应细胞A490）/靶细胞A490〕×100%.统计学方法：结果采用SPSS 统计软件分析.2结果 总RNA转染DCs稳定转染及筛选后得到的HepG2GFP细胞，能够稳定的表达GFP，荧光显微镜下所有细胞都呈现绿色荧光（图1），传代20次以上仍无消失. 与对照细胞相比，GFP基因修饰细胞在形态、生长等特性上均无显著改变，也未见GFP表达对靶细胞的毒性. 使用Trizol提取HepG2GFP细胞总RNA后，取2 μL总RNA进行凝胶电泳，可见5 s，18 s和28 s条带（图2）. 单个核细胞贴壁后，贴壁细胞在细胞因子GMCSF，IL4的作用下，培养第2日出现细胞集落，但细胞集落较小. 5 d后，集落明显增加、变大，出现具有毛刺状突起的细胞. 至7 d，集落开始减少，产生大量具有树枝状突起的细胞（图3A，B）. 荧光显微镜下，HepG2GFP总RNA转染DCs组细胞呈绿色荧光，而HepG2总RNA转染组及空白对照组则无明显荧光表达（图4A，B，C）. 图1荧光显微镜下pGFPC3稳定转染后HepG2胞浆荧光阳性 ×250（略） 图2HepG2GFP细胞的总RNA电泳（略） 图3树突状细胞形态(第7日)（略） 流式细胞仪检测细胞表型诱导d 7，DCs表达CD80 ，HLADR ，CD86 ，CD83低表达，仅；转染后上述分子表达明显升高，分别为CD80 ，HLADR ，CD86 ，CD83 ，提示转染后细胞具有成熟DCs特征. 图4总RNA转染DCs×250（略） 检测IL12分泌HepG2GFP总RNA转染DCs组上清中IL12分泌明显增加，显著高于转染前〔（±) ng/L vs (±) ng/L； n=6，P＜〕. 介导细胞毒效应HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率为（±）%，未转染的DCs刺激的T细胞对HepG2的杀伤作用为(±)%，无DCs刺激T细胞对HepG2的杀伤作用为(±)%，总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率明显高于两个对照组（n=6，P＜）. HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对SMMC7721和K562细胞杀伤率分别为(±)%和(±)%，对HepG2细胞杀伤率明显高于SMMC7721和K562细胞（n=6，P＜）. 3讨论 DCs是体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞，它在T细胞免疫中发挥着极其重要的作用〔2〕. 应用各种肿瘤抗原致敏DCs制备疫苗是近年来研究的热点 〔3-8〕. 肿瘤细胞总RNA转染DCs制备疫苗与其他方法相比，具有如下优越性：首先，它不受已知肿瘤抗原的限制，可诱导出多克隆的CTL；其次，转染所需的RNA可以通过扩增方法得到，很少量的肿瘤组织样本即可扩增得到大量的RNA〔8〕. 但目前国内外的研究中，尚未有可以明确观察总RNA转染DCs效率的方法. 我们应用稳定表达GFP的HepG2GFP总RNA转染DCs，以GFP为标记观察总RNA转染DCs的效率，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性，为肝癌临床治疗提供实验基础. 本试验中，HepG2GFP总RNA转染后的DCs在荧光显微镜下观察，胞质呈现绿色荧光，证实GFP mRNA可以在DCs胞质内正常表达，同时说明肿瘤细胞总RNA同样也可以在DCs胞浆内进行翻译表达. 转染后CD83，CD80，CD86，HLADR表达明显升高，IL12分泌明显增加，说明RNA转染，促进了DCs的体外成熟. 成熟DCs主要通过MHCI类途径，将肿瘤细胞总RNA在DCs胞质内进行翻译表达的肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞. 此途径诱导的T淋巴细胞主要为CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）. 本试验中，诱导的CTL对HepG2的细胞毒效应明显高于对照组T细胞，证实诱导的T淋巴细胞为肿瘤特异性的. 因此，在当前仍未发现肝癌特异性抗原情况下，应用肝癌细胞总RNA转染DCs制备瘤苗，诱导针对肝癌细胞的多克隆CTL，可以作为肝癌DCs疫苗的一个发展方向. 【参考文献】 〔1〕 Qin LX, Tang ZY. The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma 〔J〕. World J Gastroenterol, 2002, 8(3):385-392. 〔2〕 张红梅,任军,张利旺,等. 外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定〔J〕. 第四军医大学学报,2003, 24(1):83-85. 〔3〕 Kaplan JM, Yu Q, Piraino ST, et al. Induction of antitumor immunity with dendritic cells transducted with adenovirus vector encoding endogenous tumorassociated antigens 〔J〕. J Immunol,1999, 163(2): 699. 〔4〕 Schnurr M, Galambos P, Scholz C, et al. Tumor cell lysatepulsed human dendritic cells induce a Tcell response against pancreatic carcinoma cells: An in vitro model for the assessment of tumor vaccines 〔J〕. Cancer Res, 2001, 61(17):6445-6450. 〔5〕 Barbuto JA, Ensina LF, Neves AR, et al. Dendritic celltumor cell hybrid vaccination for metastatic cancer 〔J〕. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53: 1111-1118. 〔6〕 Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, et al. Induction of polyclonal prostate cancerspecific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumor RNA 〔J〕. J Immunol, 2001, 166: 2953-2960. 〔7〕 Heiser A, Coleman D, Dannull J, et al. Autologous dendritic cells transfected with prostatespecific antigen RNA stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors 〔J〕. J Clin Invest, 2002, 109(3):409-417. 〔8〕 Kalady MF, Onaitis MW, Emani S, et al. Dendritic cells pulsed with pancreatic cancer total tumor RNA generate specific antipancreatic cancer T cells 〔J〕. J Gastrointest Surg, 2004, 8(2):175-181.

内科护理中的责任制护理摘要】目的：要求责任制护士，必须具有系统医学基础知识和专业护理知识，还要有独立解决护理工作中疑难问题，主要把躯体护理和心理护理结合起来，使其努力达到治疗疾病，心理保健，恢复健康的共同目标。方法：通过自身用微笑和文雅举止来传递对患者的尊重友爱和人文关怀。结果：拉近了医务人员与患者之间的距离，为二者之间的交流创造了和谐的气氛，使病人不觉得在陌生的医疗环境中感到恐惧，相反得到安全，使病人心情舒畅，大大增加战胜疾病的信心和决心。 【关键词】内科病人；整体护理；责任制护理 随着社会医学科学技术的不断发展和社会环境的变化。现代医学知识量爆炸性的增加，要求护理人员自身工作素质要加速提高，特别是责任护士，必须具有系统的医学基础理论和专业护理知识，独立工作能力，熟练的各项护理技术操作水平，能解决护理操作中疑难问题，责任护士不仅仅是单纯的执行医嘱，而是在很大程度上去指导整体护理。解答患者及患者家属的询问，与病人谈心，开展心理护理，宜细不宜粗，通过努力能够达到标准，使其达到整体治疗护理的共同目标。 现实各种新药和进口药不断用于临床治疗，各处疑难病症综合治疗后的复杂护理，都对传统的护士角色提出了新的要求。也就是说，护士只有对各种新药，进口药的药理，以及用药后对病人的机理产生哪些正副作用的知识，对复杂的综合护理，不仅知其然，还应知其所以然，才能使病人及家属对我们护士产生信任感，也使护理服务能做到更为自觉更为称职，更为科学化的以人为本整体护理的共同目标。 内科疾病的病因复杂，有些疾病目前还缺乏特殊治疗，病人的康复与心理因素的关系十分密切，如果这些病人心理状态平衡，精神愉快，疾病可以迅速地缓解或得到稳定，而心理平衡失调，精神抑郁，不愿进食，还有甚至拒食，拒绝治疗，这样病情可能发展为恶化，严重者造成昏迷或死亡。实行责任制护理后，通过责任护士热情接待，院规介绍，询问病史，填写病历、查房、解答患者及家属询问，精心作出护理诊断，组织编写护理计划和及时准确记录。科学的护理计划和及时准确的病历记录，为医生对病人综合有效治疗提供科学依据。 本人曾担任数个月责任护士，直接负责15个病人，在对疾病的诊断，治疗，服药期间护理，从病人入院，我用亲人班的温暖，热情接待主动介绍医院规章制度，详细询问病史、过敏史、家族史、认真填写病历，细致查房，解决患者及亲人疑难问题，如：押金不够或不能及时继续交，面临停药的困难，本人就去住院处作担保，个别病人家住较远，有时家里亲人有事耽误，不能及时赶到身边，晚上无人陪护，我就主动晚上来到病房看望老人，有时送上饭菜，予以体贴照顾，由于我用微笑表情和文雅举止来传递对患者的尊重，友爱和人文关怀。 通过半年多本人担任责任制护理后，我能对疾病的诊断，治疗，临床症状全面了解后，使我进一步体会到我们护理工作的科学性，系统性，规律性，有计划性，有效性的整体护理一门学科，不是不被人们所关注的职业，只因她的工作虽平凡又普通，既作不出惊人的业绩，更难有伟大的创举，其工作只是打打针、发发药，巡视照看病人，天天月月年年，一年又一年的重复工作。还有人说：“医生的嘴，护士的腿”，显然是护士工作看得很低贱，只是社会上一些无知的人看法。通过数月的实践，我确确实实地感受到作为护理工作责任重大，无论是每一个细小的，不起眼的动作，或几句关心话，导致的结果大不一样，它可以是避免各种并发症的发生大大的增加患者战胜疾病信心和决心，有利于疾病的恢复能力，这样病人虽然发了钱，病情天天见好转，病人心情舒畅多了，也不觉得有病是多么有痛苦了，相反来到医院认识我们护士是个缘份，由于病人密切配合药物治疗和各项护理，患者多数很快恢复健康出院。出院时我又作出院指导及注意事项。这时患者及家属十分感谢，万分感谢!真是一个感人的场面。我曾记得当时我所负责患者中，有一位从乌鲁木齐市转回家中无法治愈的晚期肝癌的垂危病人，是我们塔城地区财贸学校的退休老干部，名子叫张兆正的一位老人昏迷不醒。他的很多亲属及子女要我们为他延长生命等待时间，这时我主动为他安排在安静舒适而又有尊严的环境中，在这个环境中能够尽量减轻病人的痛苦，安慰患者家属能够方方面面照顾亲人，以提高生命的质量，并给予心理上的关怀与支持，使患者能在有限的时光内，在充满人间温情的气氛中，安祥的，舒适而有尊严的离开了人间。这位老先生虽然去世了，这样可以使死者死而无憾，生者问心无愧。事后这家亲友及子女向我表示感谢，还清我吃饭，说我给患者细致周到的全面护理。虽没有治好也是没有办法治愈的，您做到了最大的努力，直到现在这家亲人无论在医院还是在街上碰见我都非常亲切自然，向这样事情例子就有几个家庭，经常在街上遇到不但非常亲切，还向在场的人们及她们的亲戚介绍本人态度如何，技术如何，还问我要电话号码，现在可好啦，她们家孙子或亲戚一但有不舒服就打电话咨询或者让我处理，我也很快帮忙或者亲临现场。 经过很多病人的理解和尊重，我更热爱护理工作这一行，也感到自己责任重大，有时工作很辛苦，又脏又累，还得对不同年龄，不同性别、轻、重的病人，在不同的时间，不同的阶段，想些什么，谈些什么，要求些什么，忌讳些什么，以及家属和社会对病人有过或正在发生什么，心理影响等，都能了如指掌，以便预测可能发生的行为和采取必要的心身保护措施。身心疾病，必须减轻心里压力，使其身心内部环境有效的调解，才能调动体内积极因素战胜疾病的信心和决心。这里就是心理医学自我保健知识。是我国著名医学家钟南山院士在2011年2月20日在电视讲座中强调要学习心里医学和行为医学。就是增进健康，预防疾病，恢复健康及减轻病痛。 目前，我国慢性非传染性疾病患者已占病人总数60%多，能自觉地把行为医学和心理医学有机地结合起来，预防各种传染病，非传染病，及季节病的流行与漫延，发展全民体育运动，增进全民健康，这是温总理提出口号，也就是说身体是革命的本钱，没有本钱也没有我们的一切。在这里专家提倡，早得病，早治疗，早预防既使有病要配合医护治疗，会创造出自己满意的治疗效果的。为个人、家庭、社会都会带来很大的幸福的。 参考文献 [1]《责任制护理的体会》段瑞仙363页； [2]1997年3月，全国内科护理学术研讨会362页；论文集，实用护理杂志社