核酸及其检测论文

【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. ( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNARDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参 考 文 献〔1〕 Drosten C , Gunther S , Preiser W, et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ,2003 , 348 : 1967 - 19761〔2〕 ven den Hoogen BG, de Jong JC , Groen J , et al , A newly discoveredhuman pneumovirus isolated from young children with respiratory tractdisease1 Nat Med , 2001 , 7 : 719 - 7241〔3〕 Fouchier RA , Hartwig NG, Bestebroer TM, et al1 A previously unde2scribed coronavirus associated with respiratory disease in human1 ProcNatl Acad Sci U S A , 2004 , 101 : 6212 - 62161〔4〕 Muerhoff AS , Leary TP , Desai SM, et al1 Amplification and subtractionmethods and their application to the discovery at novel human viruses1 JMed Virol , 1997 , 53 : 96 - 1031〔5〕 Lisitsyn N , Lisitsyn N , Wigler M1 Cloning the differences between twocomplex genomes1 Science , 1993 , 259 : 946 - 9511〔6〕 Lamar EE , Palmer E1 Y- encoded1 Species - specific DNA in mice :evidence that the Y chromosome exists in two polymorphic forms in in2bred strains1 Cell , 1984 , 37 : 171 - 1771〔7〕 Wieland I , Bolger G, Asouline G, et al1 A method for differencecloning : geng amplification following subtractive hybridization1 Proc NatlAcad Sci USA , 1990 , 87 : 2720 - 27241〔8〕 Milner JJ , Cecchini E , Doming PD1 A kinetic model for subtractive hy2bridizationg1 Nucleic Acids Res , 1995 , 23 : 176 - 1871〔9〕 Chang Y, Cesarman E , Pessin MS , et al1 Identification of herpesvirus- like DNA sequence in AIDS - Associated Kaposi’s Sarcoma1 Scie2nce , 1994 , 266 : 1865 - 18691〔10〕 Challoner PB , Smith KT , Parker JD , et al1 Plaque - associated expres2sion of human herpesvirus 6 in multiple selerosis1 Proc Natl Acad SciUSA , 1995 , 92 : 7440 - 74441〔11〕 Nishizawa T , Okamoto H , Konishi K, et al1 A novel DNA virus (TTV)associated with elevated transaminase levels in pasttransfusion hepatitisof unknown etiology1 Biochem Biophy Res Commun , 1997 , 24 : 92 -971〔12〕 Simons JN , Pilot - Matios TJ , Leary TP , et al1 Identification of two fla2vivirus - like genomes in the GB hepatitis agent1 Proc Natl Acad SciUSA , 1995 , 92 : 3401 - 34051〔13〕 Endoh D , Cho KO , Tsukamoto K, et al1 Application of representationaldifference analysis to genomic fragments of Mark’s disease virus1 J ClinMicrobiol , 2000 , 38 : 4310 - 43141〔14〕 Hubank M, Schatz DG1 Identifying differences in mRNA - expression byrepresentational difference analysis of cDNA1 Nucleic Acids Res ,1994 , 22 : 5640 - 56481〔15〕 Bowler LD1 Representational difference analysis of cDNA1 Methods MolMed , 2004 , 94 : 49 - 661〔16〕 Chua KB , Wang LF , Lam SK, et al1 Tioman virus , a novel paramyxo2virus isolated fromfruit bats in Malaysia1Virology , 2001 , 283 : 215 -2291〔17〕 Bowden TR , Westenberg M, Wang LF , et al1 Molecular characteriza2tion of Menangle virus , a novel paramyxovirus which infects pigs , frutbats , and humans1 Virology , 2001 , 283 : 358 - 373〔18〕 Endoh D , Mizatanil T , Kirisawa R , et al1 Species - independent detec2tion of RNA virus by representational difference analysis using non - ri2bosomal hexanncleotides for reverse transcription1 Nucleic Acids Res ,2005 , 33 : e651〔19〕 Siebert PD , Chenchik A , Kellogg DE , et al1 An improved PCR methodfor walking in uncloned genomic DNA1 Nucleic Acids Res , 1995 , 23 :1087 - 10881〔20〕 Diatchenko L , Lau YF , Campbell AP1 Suppression subtractive hy2bridization : a method for generating differentially regulated or tissue -specific cDNA probes and libraries1 Proc Natl Acad Sci U S A , 1996 ,93 : 6025 - 60301〔21〕 Hu Y, Hirshfield I1 Rapid approach to identify an unrecognized viral a2gent1 J Virol Methods , 2005 , 127 : 80 - 861〔22〕 Dean FB , Nelson JR , Giesler TL , et al1 Rapid amlification of plasmidand phage DNA using phi 29 DNA polymerase and multiply - primedrolling circle amplificationg1 Genome Res , 2001 , 11 : 1095 - 10991〔23〕 Rector A , Tachezy R , Ranst MV1 A sequence - independent strategyfor detection and cloning of circular DNA virus genomes by using multi2ply primed rolling - circle amplification1 J Virol , 2004 , 78 : 4993 -49981〔24〕 Allander T , Emerson SU , Engle RE , et al1 A virus discovery methodincorporating DNase treatment and its applicationg to the identificationgof two bovine parvovirus species1 Proc Natl Aced Sci USA , 2001 , 98 :11609 - 116141〔25〕 Stang A , Korn K, Wildner O , et al1 Characterization of virus isolates byparticle - associated nucleic acid PCR1 J Clin Microbiol , 2005 , 43 :716 - 7201(收稿日期: 2006 - 05 - 15)中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·319 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.

工作总结是对这一个阶段中自己工作的一次检查和规划，通过工作总结我们能够更好的去认知了解自己工作，更方便之后将工作做好。以下是我为大家精心整理的“核酸检测工作总结报告范文（精选7篇）”，仅供参考，欢迎大家阅读。

全面做好XX镇关于疫情防控工作部署要求，全力保障人民群众生命安全和身体健康，在镇及分管领导安排部署下，XX村顺利完成全员核酸检测工作，现将有关情况汇报如下：

一、工作开展情况

（1）推行网格管控。在各村民小组中设置网格员，共 XX名。每名网格员负责XX户村民。

（2）全面摸排登记。 X月X日，组织各村民小组组长、网格员对其小组进行全面逐户摸排现居住人员和在外居住人员情况并做详细登记，现居住人员共计 XX 人，在外居住人员共计 XX 人。

（3）强力宣传。 X月 X日至X月X日，通过微信群、广播、入户等形式，进行宣传全员核酸检测事项，提前让村民做好准备，并要求村民在其期间不得离村。

（4）合理布控。一是成立全员核酸检测专项工作组，设置组长、组员和片点负责人。二是在全村范围内划分X个核酸检测点即XX和XX，在各村民小组上设立卡点，共计 卡点。三是按照疫情防控要求合理布置场地以及做好物资后勤保障等，并于X月XX日全部完成。

（5）有序组织检测。组织村民分小组分时段到各核酸检测点进行检测，X月XX日上午X:XX开始检测，XX检测点于下午XX:XX完成全部检测，排查X人，实际检测X人，XX检测点于下午XX:XX完成全部检测，排查 XX 人，实际检测XX人，共计排查 XX人，实际检测XX人。

二、存在的问题

（1）信息采集系统较慢，导致检测进度较为迟缓。

（2）年长者的村民对手机操作不熟悉，在提前出示健康码环节上未能顺畅的衔接。

（3）工作人员在维护秩序的情况下，仍有村民插队、相互拥挤的现象出现。

三、下一步改进措施

（1）工作开展前，测试系统设备情况，做到早发现及时调整。

（2）加强乡风文明建设，做好文明宣传“持久战”。

（3）除了专人维护秩序外，增加物理阻碍，确保秩序“双保险”。

（4）在涉及手机操作时，对年长者村民区别服务。

疫情发生以来，在县的坚强领导下和上级业务部门具体指导下，县卫健委闻令而动，全民动员，精准施策，扎实做好疫情防控各项工作，确保了全县疫情防控形势总体平稳。

(一)以身垂范，机关干部全员参与。委里成立了县卫健委新冠肺炎疫情防控应对领导小组，多次召开了会议研究防控工作，制定下发了各种防控指引和文件。各班子成员不仅担任了县新冠肺炎疫情防控应急指挥部下设工作组的成员，而且身先士卒带队到高速路口、长运车站体温监测点值守，委里一名班子一直在县集中医学观察点坐镇指挥。机关干职工也纷纷投入到疫情防控一线工作，

(二)排查监测，有效阻断疫情输入源头。

(三)不惧危险，千余医护战士逆行“战疫”。疫情期间，我县出现了XX例确诊患者、XX例疑似病例，面对未知的危险，县乡村各级医疗机构的XXXX多名医护人员都牢牢坚守在抗疫的第一线工作，积极参与人员摸排、健康监测、流调消杀，防控指导、舍小家为大家，没有任何怨言。

(四)从无到有，核酸检测工作有序推进。

(五)中药干预，充分发挥中医特色优势。采取中药汤剂、艾熏和热敏灸等中医药手段进行预防，每日向疫情防控一线的医务人员、工作人员、园区返岗人员等人群发放预防用中药汤剂，采取艾熏和热敏灸等中医药手段预防，累计向医院、复工复产企业和集中医学观察点等场所发放艾芯XXXX条；选派县中医院X名中医师加入市中医药专家组，协助配合定点救治医院的中医药治疗。

(六)严防死守，抓实医院感染防控工作。严格落实发热门诊管理要求，加强患者收入院管理，加强陪护、探视的管理，强化新冠病毒核酸检测，严格落实标准预防，开展院内感染风险排查整顿。通过抓实抓细医疗机构院内感染的各项工作措施，切实做到院内闭环管理，确保了医疗机构零感染。

(七)精心安排，全力以赴保障防控物资。一是多渠道争取物资来源，由各部门和社会各界踊跃提供采购信息，县卫健委一名班子专门负责对接落实；二是物资进出管理规范。入库填写入库单，由仓管人、审核人签字，物资出库填写申领单，审核同意后再领取防控物物资，紧缺物资申领报县疫情应急指挥长批准；三是物资分配每日日报，由县指挥部常务副指挥长、副指挥长等领导签字。

(八)储备人员，做好疫情防控准备。一是组建了流行病学调查队伍，共计XX人，均为县疾控中心、县乡医疗机构公卫人员，调查队伍分成了X个梯队；二是组建了核酸采样后备队伍，抽调了XX名乡镇卫生院医护人员人作为核酸采样储备人员，从XX月XX日开始分批次到县XX医院跟班操作学习；三是组建了核酸检测检验后备队伍，乡镇卫生院X名检验专业人员全部作为后备力量，目前正分批次在县XX医院跟班操作学习。

(九)积极备战，开展防控实战应急演练。

20XX年X月XX日至X月XX日X天时间，在辖区内开展了全员核酸检测采样工作。X月XX日下午，社区召开了全员核酸检测工作总结大会。会议由社区书记XX主持。

会上，XX书记就本次核酸检测经验做法、问题不足、意见建议等方面进行了总结。此次全员核酸检测，设立X个点X个台，划分社区和XX大厦两个区域，由X名社区干部专人负责。我们一直秉承先自给自足，再向街道求援的理念，紧紧抓住共建单位资源和群众骨干力量，向市XX、XX销售公司、中小企业大厦等单位征集笔记本电脑，由共建单位负责人推荐熟练电脑操作的年轻职工配合社区干部做好登记及扫码指导工作，从三长和志愿者中选树健康、有热情、有能力的男性同志，按分工做好维持秩序、喇叭宣传及核酸检测早晚的摆台撤台等工作。使X日的检测工作顺利完成。检测工作还存在志愿者参与服务参差不齐、政策解答不及时存在舆情风险等不足。

通过此次大会，总结了检测工作中的经验与不足，为第X轮的检测工作顺利进行奠定基础。

x月x日，xx街道xx社区居民免费核酸检测工作启动。在位于xx路xxx号的核酸检测点，随处可见忙前忙后的志愿者们。他们中，有社区干部的家属，也有家住辖区的大学生……在他们的协助下，经过xx个小时的连续奋战，铁四社区顺利完成了当日的核酸检测工作。

开展核酸检测时间紧、任务重，为保障各项工作有序、高效开展，当天x时，志愿者们便准时到达核酸检测点，接受相关培训。工作开始后，大家根据调度安排，各司其职，分别投入到指导居民填写核酸检测表格、维持现场秩序、打扫场地卫生及进行场地消毒等各项工作中。

很多志愿者由于需要不停地大声说话，嗓子变得沙哑，但他们却顾不上喝一口水，仍争分夺秒地引导居民有序排队，帮助大家顺利完成检测。接受检测的居民说，坚守在寒风中的志愿者用行动守护着大家，带给大家别样的温暖。

为认真贯彻落实疫情防控工作重要指示精神，严防疫情扩散。20xx年1月17日晚上电话通知每一户居民提前做好核酸检测准备和相关注意事项。

1月18日早上7:00全民检测工作全部准备到位，按照应检尽检、愿检尽检、不漏一户、不漏一人，网格长和工作人员以小区楼栋、单元为单位引导居民来到xx市第八中学采集点进行核酸检测工作，确保全民检测工作有序开展，采集地点有明显的入口标识，采集场地内部有明显一米线标识，居民按顺序依次做检测。

为确保安全，街道领导对核酸检测现场再次检查，要求工作人员认真核对好检测人员的身份信息，做到规范、科学、快速有序开展登记和检测工作，做好检测人员的衔接，最大限度提高检测工作效率。目前采集工作仍在有序进行中。

一、新冠肺炎疫情防控阻击战取得阶段性胜利

疫情发生以来，在县委、县政府的坚强领导下和上级业务部门具体指导下，县卫健委闻令而动，全面贯彻落实上级工作部署和要求，全民动员，精准施策，扎实做好疫情防控各项工作，确保了全县疫情防控形势总体平稳。

(一)以身垂范，机关党员干部全员参与。委里成立了县卫健委新冠肺炎疫情防控应对领导小组，多次召开了会议研究防控工作，制定下发了各种防控指引和文件。各班子成员不仅担任了县新冠肺炎疫情防控应急指挥部下设工作组的成员，而且身先士卒带队到高速路口、长运车站体温监测点值守，委里一名班子一直在县集中医学观察点坐镇指挥。机关干职工也纷纷投入到疫情防控一线工作，春节前后的40多天在家的干职工没有一个人临战退缩。

(二)排查监测，有效阻断疫情输入源头。疫情防控前期，委里按照指挥部指令在高速路口、国省道县际交界处均设置了临时检测点，机关工作人员和医疗机构抽调人员24小时值守，做好进出人员排查监测，要求外来人员入境一律居家观察14天，累计检查进出车辆11000余辆次(日最高车流量1230辆、日最低车流量200辆)、人员20000余人次。

(三)不惧危险，千余医护战士逆行“战疫”。疫情期间，我县出现了5例确诊患者、5例疑似病例，面对未知的危险，县乡村各级医疗机构的1000多名医护人员都牢牢坚守在抗疫的第一线工作，积极参与人员摸排、健康监测、流调消杀，防控指导、舍小家为大家，没有任何怨言。与此同时县人民医院王印花和县中医院11名医护人员自愿请缨分别赴武汉、疫情救治前线工作，谱写了一曲曲“战疫”壮歌。企业复工复产之际，抽调12名医务人员驻企全程指导企业疫情防控，为全县园区企业顺利复工复产提供保障。

(四)从无到有，核酸检测工作有序推进。截止10月20日，全县累计核酸检测5110人份，其中560名发热门诊患者、1086名新住院病人、183份冷链场所标本进行了核酸检测。县人民医院PCR实验室9月1日正式投入使用，县疾控中心PCR实验室已经完成主体工程，10月22日通过了评审验收并投入使用。

(五)中药干预，充分发挥中医特色优势。制定了《关于充分发挥中医药在新型冠状病毒感染的肺炎救治作用的意见》《关于新型冠状病毒感染的肺炎中医药防治方案》，采取中药汤剂、艾熏和热敏灸等中医药手段进行预防，每日向疫情防控一线的医务人员、工作人员、园区返岗人员等人群发放预防用中药汤剂，采取艾熏和热敏灸等中医药手段预防，累计向医院、复工复产企业和集中医学观察点等场所发放艾芯6645条；选派县中医院2名中医师加入市中医药专家组，协助配合定点救治医院的中医药治疗。

(六)严防死守，抓实医院感染防控工作。严格落实发热门诊管理要求，加强患者收入院管理，加强陪护、探视的管理，强化新冠病毒核酸检测，严格落实标准预防，开展院内感染风险排查整顿。通过抓实抓细医疗机构院内感染的各项工作措施，切实做到院内闭环管理，确保了医疗机构零感染。

(七)精心安排，全力以赴保障防控物资。一是多渠道争取物资来源，由各部门和社会各界踊跃提供采购信息，县卫健委一名班子专门负责对接落实；二是物资进出管理规范。入库填写入库单，由仓管人、审核人签字，物资出库填写申领单，审核同意后再领取防控物物资，紧缺物资申领报县疫情应急指挥长批准；三是物资分配每日日报，由县指挥部常务副指挥长、副指挥长等领导签字。四是捐赠物款统筹使用。社会各界捐赠的各类防控款物由县红十字会、县慈善总会、县物资保障组负责接收，接收物资统一由县物资保障组储备保管，接收款项纳入县新型冠状病毒感染的肺炎疫情防控应急资金统筹使用。

(八)储备人员，做好秋冬季疫情防控准备。一是组建了流行病学调查队伍，共计14人，均为县疾控中心、县乡医疗机构公卫人员，调查队伍分成了四个梯队，10月11日进行了集中业务培训；二是组建了核酸采样后备队伍，抽调了54名乡镇卫生院医护人员人作为核酸采样储备人员，从10月12日开始分批次到县人民医院跟班操作学习；三是组建了核酸检测检验后备队伍，乡镇卫生院7名检验专业人员全部作为后备力量，目前正分批次在县人民医院PCR实验室跟班操作学习。

(九)积极备战，开展防控实战应急演练。10月13日下午，我县在广场举行了秋冬季新冠肺炎疫情防控应急演练。副县长、指挥部常务副指挥长到场指导。县卫健委、县人民医院、县中医院、县疾控中心、县公安局、镇人民政府等单位60余人参加了演练，演练按照疑似病例发现、采样检测、信息报告、流行病学调查、病例转运、人员管控、环境消杀、集中留观、防控宣传等内容依次展开。

二、其他重点工作齐头并进

(一)党的建设方面。

全面从严治党，党的建设不断加强。卫健委党委始终把党的政治建设摆在首位，不断巩固拓展主题教育成果，扎实落实“不忘初心、牢记使命”的制度，强化政治监督，严明政治纪律和政治规矩，严格执行新形势下党内政治生活若干准则，引导全系统广大党员干部增强“四个意识”、坚定“四个自信”、做到“两个维护”。加强意识形态领域工作，深入推进“两学一做”学习教育常态化制度化。进一步加强机关党组织建设和公立医院党的建设，切实发挥党组织作用，提升各级党组织政治功能和组织力。全面落实公立医院党建重点任务，加强党对公立医院的领导，落实党领导下的院长负责制，健全相互制约又相互协调的权力结构和运行机制，推进权力运行程序化和公开透明。坚定不移正风肃纪反腐。落实党风廉政建设责任制，推行党风廉政建设重点工作项目清单制，持续深入整治“好人主义”突出问题，加大违反中央八项规定及其实施细则精神的查处力度。重点聚焦医疗卫生服务和行业监管中的不正之风，加大监督执纪问责力度，塑造行业风清正气。

(二)卫生县城创建方面。

今年以来，我委按照省、市、县关于开展城乡环境综合整治活动的有关要求，多次召开会议安排部署相关工作，各项工作扎实有效开展，取得了明显实效，推进了环境卫生综合整治行动。针对疫情防控中发现的环境卫生问题，特别是老旧小区、城中村、城乡结合部、农贸市场、小餐饮店、小作坊、流动摊贩等环境卫生管理的薄弱环节和一些长期存在的“老、大、难”问题，结合省级卫生城镇创建工作总体要求，逐项梳理问题清单，及时整改落实，切实为人民群众解决实际问题和困难。

卫健委把创建省级卫生县城作为一项重要的政治任务，统一思想、履职尽职主动作为，坚决打好这场攻坚战、持久战。主要做到了以下三个方面的“提升”：

一是明职责，提升了创卫工作的主动性。

卫健委在创建省级卫生县城工作中顺利完成以下四方面职责：

一、业务指导到位。按照创卫要求，全程对创建省级卫生县城全过程进行业务指导。

二、专线管理到位。认真贯彻落实《传染病防治法》《职业病防治法》《公共场所卫生管理条例》等有关法律法规，加强医疗、学校、社区、企业等重点领域公共卫生服务体系建设。对照《病媒生物预防控制管理规定》积极开展以环境治理为主的病媒生物综合防制工作，定期发布病媒生物密度监测结果和预警预报。规范医疗废弃物和排放的医源性污水处置。

三、医疗卫生机构创建的达标到位。建立完善卫健委机关、全县各级医疗机构环境卫生保洁工作制度，对办公楼、食堂、职工宿舍、厕所、仓库、车库等场所进行全方位大清扫，建立长效管理机制，做到环境整洁、不漏死角。

四、片区联创到位。xx社区13项整治达标全到位，全面完成各项创卫指标。

二是懂业务，提升了创卫工作的指导性。

创卫工作是一项系统工程，技术含量高，省里评价指标有八大类四十小项，三项一票否决，共计1000分，验收评估获得800分以上才能获得省级卫生县城称号，为此，一是我们自身认真学，组织全系统干部认真学习创建省级卫生县城评分工作标准指引，做到人人懂业务。二是发挥行业自身优势，请省级创卫专家来现场培训指导，通过培训使全县创卫工作重点突出，目标明确，任务具体，责任清晰，整治范围全覆盖，不留死角，消除盲区，特别是背街小巷，城中村，城乡结合部，闲置地等薄弱环节创建效果显著，群众满意。

三是善落实，提升了创卫工作的实效性。

创卫工作难点多、堵点多、任务重、压力大、时间紧，我们办好自己的事，解决好思想认识不到位，干事没激情，好人主义思想严重的问题。一是依靠群众。依靠群众是创卫成功的关键，我们加大宣传力度，传播正能量，积极发动群众参与创卫工作。二是组织干部，一分部署，九分落实，干部是创卫的'重要群体。我们结合本系统创卫工作实际，将创卫工作任务清单化、项目化，明确责任人，使人人身上有担子、肩上有压力，干部的积极性得到充分调动，创卫激情得到充分涌动。三是班子带头。安排班子作为联创片区专线管理的责任人，积极负责片区的创卫工作。四是上下联动。委机关与全县各医疗卫生机构建立横向到边、纵向到底的创卫新格局。

(三)健康扶贫方面。

建档立卡贫困人口参加城乡居民基本医保个人缴费部分由财政给予补贴；优化医疗费用决算服务模式，按照《省贫困患者县域内“先诊疗、后付费”服务工作方案》，实行县域内住院“先诊疗、后付费”和一站式结算，贫困人口住院时不需缴纳住院押金，由定点医疗机构与基本医保，大病保险，商业补充保险，医疗救助经办管理机构之间进行决算，减轻贫困患者垫资压力，确保其得到及时、安全、规范、有效的治疗。至10月份底，贫困户门诊住院5996人次，贫困人口个人自付比例控制在10%；完善了定点医疗机构的扶贫病床(病房)设立，县人民医院及县中医院按照总床位数的5%设置扶贫病床，每个乡镇卫生院至少2张扶贫病床，全县共设置58张扶贫病床。

为有效应对可能出现的疫情，对防控区域人员实施“应检尽检”，根据XX市疫情防控指挥办关于做好大规模核酸检测筹备工作的通知要求，我镇于X月XX日晚上XX在XX、XX村委会开展了大规模核酸检测工作。现将有关工作总结如下：

一、高度重视，做好核酸检测准备工作

我镇接到XX市疫情防控指挥办关于做好大规模核酸检测筹备工作的通知要求后，镇高度重视，立即召开班子会议专题研讨，卫健办立即制定我镇区域大规模核酸检测的工作，成立以镇书记为组长的核酸检测指挥中心，同时将工作方案人员职责具体落实到镇村领导职工。同时，卫健办依方案要求购买核酸检测物资清单，保证核酸检测顺利进行。

二、做好区域大规模核酸检测宣传发动工作

X月XX日上午，X镇、XX宣传发动组工作人员通过入户通知的方式全方位开展核酸检测工作的发动工作，务求使更多的居民参与检测。宣传组入户的同时，还带上葵花码，指导村民提前扫码截图。

三、大规模核酸检测工作有序开展

X月XX日晚上XX：XX，全体工作人员行动起来，按岗就位。晚上XX：XX，X镇、XX大规模核酸检测工作有序开展，收到通知的居民群众早早戴好口罩排队参加核酸检测，在工作人员的指引下经过测温，亮码后进入等候区，按指引进行核酸扫码登记。现场群众严格按照一米间隔轮候，有序进入到核酸采样区，配合医护人员进行采样工作。为照顾老人、小孩及行动不便的人员，核酸检测点特设一条快速通道，体现了人性关怀。

本次演练截止时间为晚上XX：XX分，X镇采样点采集样本XXXX份，XX采样点采集样本XX份，全镇总共采样XXX份。我们这次演练取得了不错的成绩，但也存在以下几个问题：一是工作的人员安排不够合理。有一部分干部职工没有利用到位；宣传发动组的人员一部分也是后勤保障组人员，导致布置场地时缺乏人手，速度慢；二是场地的利用有待提高。布置场地时未能充分利用场地，缓冲区的设置与人流量不相匹配，人流量过多时人员密集，达不到一米间隔；三是基础设施薄弱。采集现场无安装加强信号器，采集人员用手机录入信息，无配备平板电脑，录入速度慢。

在今后的工作中，我们要做好方案，调动全体镇村干部积极参与并合理安排，同时做好合理规划、充分利用场地，并提前安装信号加强器，采购平板电脑，为必要时实施全镇全人群筛查做好准备。