诱变育种文献综述论文

浅谈食品工业中产香酵母的应用论文

1引言

产香酵母又名酯酵母，是一类能合成具有芳香气味的酯类物质，如今产香酵母早已不局限于产酯而是在生产过程中能产生让人喜欢闻的香味的各种酵母，香气多为醇类、酯类、酚类、酮类、芳香类等具有挥发性风味的物质，主要的香气类型有：花香型、清香型、果香型等，常被广泛应用于酿造、调味品、功能饮料、无醇饮料、食品等领域的增香。

2产香酵母在农产品中的应用

2．1产香酵母在果酒中的应用

果酒的口感、风味以及质感在果酒发酵酿造生产中起着很重要的作用，尤其是其中的风味是评价果酒优质的一个重要指标。因此果酒增香已成为现今果酒发酵酿造中的一个热门研究课题。果酒品质丰富、种类多样。张大为等从酥梨自然发酵汁中得到了一株不仅糖利用力低而且还可以增加梨酒香味的东方伊莎酵母，并将其作为梨酒生产中的产香菌使用。曹新志等从四川自贡本地梨果中筛选出了一株产香酵母FL－5，产酒精、产酸、产酯能力较好，且发酵周期短。何义从梨果园中分离出一株产香性能好的酿酒酵母Y－5，确立了梨酒酿造工艺，发酵产生的风味明显优于工业菌株ADY，能较好地保留鸭梨的原香味。赵海霞等则从苹果皮中分离出一株孢汉逊酵母属的产香酵母，适合苹果酒酿造，所得苹果酒品质优良，具有苹果酒的典型风味。古其会［5］等从多种成熟的水果皮上分离出一株对病原菌有抑制作用的产酯酵母，可用于番木瓜酒的酿造，经过分子生物学鉴定为梅奇酵母。王雪莹从甜橙果皮上筛选出两株性能优良的酵母S017和F076，其中S017产酯量高达86．75％，而F076发酵过程中产生的萜类物质相对含量比S017高，具有保留原料特殊香气组分的能力。艾方等从柑桔中分离出了两株能够耐受较高的盐、糖浓度的产香酵母，现已用于浓缩果汁和低醇果酒的增香。沈昌从水果、土壤中分离筛选出产香能力较强的酵母N－2，用于紫甘薯发酵酿造，经优化发酵工艺得到了花色苷含量保存多、还原糖浓度低、酒精度高、色泽鲜丽的紫甘薯发酵产品。此外李剑芳从自然发酵猕猴桃汁中分离出一株柠檬形克勒克氏产香酵母E－45，经鉴定为能产醇类、酯类等芳香物质的低发酵力产香酵母，可用于葡萄酒等果酒的增香。自然选育出的产香酵母菌株与工业菌株比较，具有专一性酿造的优势。曹新志等筛选出的产香酵母FL－5与安琪酵母DC－2相比，FL－5酿造的果酒风味更优。袁丽从不同水果中筛选出两株产香酿酒酵母菌GY1、GY2并与安琪酵母相比，GY1、GY2均优于安琪活性酵母。张翠英也从葡萄皮中筛选出一株产香酵母经诱导得到一株在低温条件下仍具有较强的发酵能力，与优良葡萄酒酵母比更具优势。王雪莹分离的S017以果酒干酵母为对照，S017所酿造的甜橙果酒色泽、澄清度、酒香均具备优质果酒的感官品质，在酿造工业中有较好的应用前景。

2．2产香酵母在白酒中的应用

在白酒生产中为了增加酒中的独特风味通常会加入某些化学物品以增加酒的香气，可最终酒中的香气都较为单一。自然酿造的白酒通常会以酒曲窖泥为分离源，筛选耐高温、性能优异、适合白酒增香的产酯酵母，经酿造的白酒经产酯酵母自身合成的风味物质比添加化学物质更多样化，风味更丰富独特，因此越来越多的白酒生产也用产香酵母增香。通常产香酵母的筛选都从大曲发酵的酒液或糟醅中筛选。郭志从泸州老窖窖泥中分离出一株耐受高温的酵母菌，属于异常汉逊酵母属。通过产香条件的响应面优化，得到耐受高温酵母，产生的2－正戊基呋喃、苯乙醇等香气物质，产量比原来浓香型大曲高出约两倍左右。蒲春等从大曲中筛选出一株酶活性高的产香酵母菌并对其功能特性进行测定，产香浓郁，可与其它产酒量高的菌种混合发酵。张春林对大曲发酵液进行了酵母分离，筛选出产香酵母ZY－1和GY－3，通过模拟探索出发酵中产生香气成分的机理，提出了产香酵母是大曲中风味物质形成的重要原因。顾宗珠等从酒曲中筛选出一株产酯量高的酵母，通过正交试验确定最适培养条件，提高白酒品质生产。王晓丹等从贵州某酒厂酒醅中筛出一株产乙酸乙酯的平常假丝酵母、一株产乙酸苯乙酯的毕赤氏酵母。对两株菌进行感官评价和GC－MS检测，结果显示两株酵母即产酒又产香、可将其用于香料和酒类发酵。周世水等从酒曲富集液中筛选出一株Y2－7，发酵后酒精度可达60％、总酯量为2．1g／L，酒液醇香明显。

2．3产香酵母在低醇饮料中的应用

酵母类群中有一类酵母的产酒能力极差、但产酯、产酸、产酮类物质优良，市场对保健品的推行下，各种无醇、低醇饮料出现在生活中，为了此类饮料的广泛应用，满足广大消费人群，工业生产中常用低醇产酯酵母来提高风味。程晨从自然发酵果浆中筛选出发酵速度快且风味好的酵母C7，并将其用于低醇饮料的工艺研究，效果显著。赵晓［20］通过对五株不同来源酵母菌进行生物学特性进行研究，最后筛选出一株适合格瓦斯发酵的酵母菌Y3，可以用于生产具有面包香气的格瓦斯。格瓦斯是以谷物及果蔬为原料经由酵母菌和乳酸菌发酵一种含低度乙醇的饮品，它即具有啤酒的淡爽、香醇的特征，也具有碳酸饮料的清凉爽口特性在。低醇发酵的工艺研究中，孙丙升［21］在新疆，青海，陕西，甘肃四个地采集土壤并进行筛选，最后选出优良的白地霉GS28B和SX71A做为无醇类饮料的生产菌株，根据菌种生理特性，正交试验确定两株菌的最佳工艺组合：温度为24℃，蛋白质含量为1．0g／L，摇床转速为160r／min，GS28B接种量为5．0％，SX71A接种量为2．0％，通过GC－MS测定香气成分为酯类和2－苯乙醇，发酵生产中乙醇含量只有0．02％和0．03％，基本达到了无醇要求，毒理学评定也确定了此类无醇饮料对身体无毒。

2．4产香酵母在调味品中的应用

酵母由于功能各异、长发酵产物丰富，自身理化性质有别，不同环境的酵母会有不同的特性，酵母生存环境分布十分广泛，伴随着酿酒酵母的不断发现，研究者将菌源扩展到食品、调味品等领域，筛选出具有特殊能力的产香酵母，避缺选优的应用于调味品及农产品中。闫美从辣椒酱中筛选出一株耐盐性高达24％的鲁氏产香酵母，主要产具有玫瑰花香的苯乙醇。并与球拟酵母应用于酱油酿造。王刚等从泡菜和豆浆中筛选出一株具有潜在应用价值的产香酵母YG28B、YG28B，与活性干酵母用于发酵面包，风味独特。韩志双等从发酵豆瓣酱中筛选出一株产特殊香味物质、耐盐、发酵力强且产香的异变球拟酵母，在豆瓣酱发酵过程中能增添风味和口感。匡钰从菠萝皮上筛选出一株发酵性能好的酿酒酵母，用于果醋的发酵酿造，所得菠萝果醋具有菠萝的特殊香气，果香爽口。冯杰在对酱油发酵研究中，以一株耐高盐增香酵母菌埃切假丝酵母为研究对象，用浓度为240g／L的氯化钠对菌株进行驯化以提高酵母在酱醪中的适应能力，并通过对发酵工艺的调控，采用两阶段添加法研究了酵母对酱香风味质量的促进，较对照组酵母对主要酱香物质均有所增加，进一步丰富了酱油成分，促进了酱油的风味，提高了酱油的品质。为了提高虾酱的香气和品质，连鑫等从虾酱中分理处一株季氏毕氏产香酵母，该菌产香能力较强，耐盐度达10％，经过驯化可作为虾酱复合发酵剂的菌株使用，用于提高香气度低盐虾酱的发酵。高健等从莴苣中得到一株产香酵母命名为G0901，主要产柠檬烯，相对含量可达20％。较现今柠檬烯生产大多从植物精油中提取，G0901的分离为利用微生物高效生产柠檬烯提供了较好的研究材料。单艺等从传统云南糯米酒中分离出一株产酯能力较强的Y2，通过实验测试，可用于增加酯香味米酒生产中。张世秀等从天然点浆剂酸浆中分离出一株产香性能好的酵母CF610，所产香气浓郁，主要香味物质为苯乙醇。梁辉等从传统腊鱼中分离出两株产香酵母：季也蒙毕赤酵母和平滑假丝酵母，并对两株菌进行理化性质分析，平滑假丝酵母发酵适应性优于季也蒙毕赤酵母，可成为新型肉品发酵剂。

2．5产香酵母在烟叶中的应用

通常多酚等香味前体物质产生的已酸甲酯、苯乙酸甲酯、愈创木酚、异戊醇等挥发性香味物质，对改善烟叶香味品质具有重要的应用价值。张知晓从烟叶中分离出一株产香白地霉13－1，白地霉具有脂肪酶活性，经过线性相关性比较证明脂肪酶是影响白地霉酯类挥发性物的关键因素之一。用白地霉发酵烟叶能显著减低烟叶中还原糖。吕品等从自然陈化的白肋烟叶中分离出产生特殊酸性物质的酵母CB－2，并将其用于香料生产，发酵出的香料具有提高卷烟烟气香气质、降低干燥感和刺激感，柔和了烟气。马海昌也表明利用生香酵母对烟梗发酵液发酵，得到的香料口感以及风味都比枯草芽孢杆菌好。

3产香酵母在酿造中的工艺技术

3．1工艺参数优化

生产中单一的菌株只能提高单方面的风味，而与其它菌株混合运用不仅能很好的利用发酵液中的原料，而且混合发酵时可以产生多种芳香类物质是单一菌种不能合成的。陆振群从优质白酒曲中筛选诱导出一株产乙酸乙酯量多的生香酵母S8，但浓香型白酒的主要香味成分是已酸乙酯，为了获得已酸乙酯，将产酯酵母S8与已酸菌复合培养，能产生大量的已酸乙酯，为浓香型白酒的生产提供了一定的研究意义。丁玉振研究了产香酵母的发酵规律和在醇香果汁生产工艺上的应用。通过实验论证证明低温能有效的控制菌株的发酵进程，低温有利于发酵香气的纯正和圆满，确定在10℃下发酵香气浓郁，将产香酵母与低温发酵工艺结合应用。

3．2共固定化技术

共固定化技术是固定化技术和混合发酵技术基础上发展起来的新技术，将几种细胞同时包埋与同一载体形成稳定的固定化细胞系统。可发挥不同微生物的协同作用。贺江将产酯酵母AS2．300用于多菌种共固定化技术进行苹果醋的酿造，当酵母菌1450、产酯酵母AS2．300、乳酸菌按比例（6∶3∶1）发酵可得到品质良好的苹果醋，相比酵母菌和醋酸菌共固定化颗粒酿造，其发酵性能可以长时间稳定，比酵母菌与醋酸菌共固定化更具优势。同时也避免了液体发酵和固体化技术在品质上的`不足，发酵速率也明显高于文献报道的数据。王克明等［38］在多菌种固定化技术应用于各类发酵的研究中，将红曲霉菌、葡萄酒酵母、产香酵母、嗜酸乳酸菌按比例（3∶2∶2∶1）发酵成苹果酒饮料；将根霉、酿酒酵母、产香酵母按比例（4∶3∶2）发酵成保健红醋，并确定此比例是最佳菌种配量。通过实验得出发酵功能稻米乳饮料的多菌种配比为根霉、酿酒酵母、产香酵母、嗜酸乳酸菌的比例（4∶2∶2∶1）［40］。探讨了苦瓜保健醋中根霉、酿酒酵母、产香酵母、醋酸菌的比例（4∶2∶2∶1）。以酿酒酵母、产香酵母按（4∶1）比例发酵海藻酒、效果显著［42］。以苦瓜为原料，采用固定化酿酒酵母、产香酵母（4∶1）酿造苦瓜酒。

4产香酵母在细胞工程中的应用

随着酿造工艺的发展，饮品的增多，微生物的利用也越来越频繁，从自然界中直接分离的菌株已不适合直接用于工业生产。为了获得更优良的菌株，构建工程菌成了现在的主要手段，在微生物中主要运用诱导育种及原生质体融合技术来获取工业菌种。

4．1原生质体融合技术应用

林小江利用原生质体融合技术将生香酒曲中分离的生香酵母HTE－2和经诱导选育的低甲醇酿酒酵母LM－1进行融合得到PF1。通过生理特性测定，酿酒工艺优化（温度19．07℃、时间5d、糖度17．34％、pH值4．34、接种量2％）使甲醇含量下降，总酯含量提高。以大米、小麦为原料用PF1酒曲可酿造高品质的蒸馏酒。张大为［45］从陕西兴平市梨园里面采样分离出两株酵母，一株酿酒酵母，一株产香酵母，通过原生质体融合技术，将两种菌的优良性状相结合构建基因工程菌。通过理化性质的测定，所融合的酵母具有产酒率高，产香率高的优良酵母，利用中草药代替二氧化硫的作用并与工程菌结合酿造。金磊也从陕西兴平市果园采样筛选出酿酒酵母YDJ05和产香酵母YS03通过原生质体融合技术将YDS05作为亲本菌株X，YS03通过EMS诱变得到一株精氨酸营养缺陷型菌株Y，将XY融合，筛选出一株发酵能力强，产香能力强的双亲优良特性作为适合酿造梨酒的酵母菌株。李锐利从小曲酒的酒曲中分离筛选出高产乙酸乙酯酵母菌株Y1，通过原生质体融合，诱变育种等手段对菌株进行改造得到BY2，稳定性好。并对酵母产酯条件进行了研究，最后将选育的菌株用于清香型小曲白酒酿造，可提高清香型白酒的质量。王林松利用原生质体融合技术以产香优良酵母PF14为融合亲本X，发酵力好的酵母为融合亲本Y进行融合筛选得出具有两种酵母性能的菌株。通过GC－MS对其香气进行鉴定分析，对工程菌株进行了发酵动力学研究，很好的解释和预测了发酵过程中的动态变化。

4．2诱变育种

彭帮柱以酿酒酵母菌株作为诱变出发菌株，利用甲基磺酸乙酯（EMS）进行诱变，得到一株产香的赖氨酸缺陷性突变株，将其作为亲本与发酵力强的酵母进行原生质体融合，通过GC－MS对融合子进行香气成分鉴定，最后筛选出三株产香、发酵能力均强的增香型适合苹果酒酿造的菌株。张翠英以葡萄味分离源，筛选出具有较好产香能力的YU2．28并通过60Coγ射线诱导果酒酵母菌YU2最后选育出耐低温的S15．3。将这两种菌混合发酵后产品比市售的干白葡萄酒品质更佳，对产香酵母发酵的培养基配方进行了研究，最后得出在pH值5．5，添加2％乙醇，0．1％乙酸，培养温度18度，并以玉米粉为基质生长，产香能力强且成本低廉。

5结论与展望

目前，国内对产香酵母已较为全面和广泛的应用，但仍存在有待发展的地方。比如产香酵母菌发酵食品的种类和产量上与发达国家相比还有一定的距离。许多产香酵母的制品还没有形成工业化生产，应最大程度利用产香酵母菌发展产品的优势，研究开发更多的新型品种，使之投放市场。产香酵母分离筛选应用仅仅局限于可以培养的酵母，然而在自然界中可被培养的菌株仅占酵母类群的很小一部分，限制了产香酵母的应用。酵母菌群在发酵过程中不应局限于几种酵母的应用，因多菌群相互作用，可使风味多样化，而在现在的果酒酿造中还是运用单一酵母较多，产香型酵母的研究主要局限在酿造和调味品的应用。还未广泛的应用于其他生活领域；如酵母酶类的应用、产香物质的提取等。在工业生产中大多数都没有根据特殊的菌株去生产具有特异性的产品还是沿用常用的工业菌株，限制了产香酵母的发展。在我国在酿造工艺中技术相对于发达国家还有一些差距，酿造时有害微生物的存在不可避免，而如何避免产香酵母与有害微生物的竞争、如何保证产生的香味物质不被破坏不会挥发方面的研究存在不足。因此，在优良菌株的选育方面需进一步研究以提高产品的产量和品质。产香酵母也是一种重要的单细胞微生物，与人类日常生活和工业应用有这密切的联系。作为酵母的一种也是人类利用最早，应用最广泛，人类直接食用最多的一种微生物。具有发酵，营养强化，增味等功能。当今世界食品发展的潮流是保健食品，即不仅具有食品色香味，而且还具有调节人体生理功能的作用。因此从产香酵母菌发酵食品特点来看，所发酵的食品则属于保健食品，符合时代要求，有强大的生命力和广阔的前景。利用产香酵母开发更多的有利于人体健康的食品，应用高新技术开发酵母在食品上得使用。随着分子生物学、遗传学、基因工程等的发展，从分子水平出发研究产香酵母将会成为研究的主要方向。基因工程菌的建立也会加快产香酵母的应用，在以后各种菌株的应用中，酵母菌群的生态平衡发酵有望成为热门课题。在工业生产中、微生物的发酵生产比化工工业生产相对较环保、产率高、产物副作用小等优势，产香酵母在以后的发展中有望在日用品、农用品、食品、保健品、化妆品等领域广泛应用。

药学毕业论文开题报告篇3 题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响 研究现状： 一、普鲁兰酶 普鲁兰酶(Pullulanase，EC.3. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1.6糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆Klebsiella.pneumoniae)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。 在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( E.C3.2.1.68, Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶(E.C3.2.1.41Pullulanase )，异淀粉酶( E.C3.2.1.68, Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( E.C3.2.1.69,Amylopectin-6-gluanohydrase )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。 在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。 二、普鲁兰酶的研究现状 1.产普鲁兰酶的微生物 普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。 1.1蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus Var.mycodes) 由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～6.5，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。 1.2嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌(BaciIluS.Acidopullulyticus) 上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热 (60℃)，耐酸(pH4.5)。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。Bacillus.Acidopullrrlyticus呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于6.5以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基((pH4.8 ～5.2)上生长良好。 1.3枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis) 1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为7.0～7.5，但在pH5.0时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。 1.4耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes) 1987年.德国的E.madi等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在pH4.5～6.0有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域. 1.5 Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans,Bacillus.Acidopullulyticus 上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在pH6.5以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。 1.6产普鲁兰酶的高温菌菌种 自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, pH6.3, Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, pH6.0, Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,pH5.5, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, pH6.0o 2.普鲁兰酶的分子结构 至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～1.4,α～1.6,α～1.2,α～1.3,α～1.5,α～1.1糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。 3.普鲁兰酶的应用 普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与 其它 淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用: 3.1单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉 直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。 3.2普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪 饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～1.6糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。 试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量1.5%(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，pH5.8;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加14.8，麦芽糖含量平均增加了45.6，糊精含量平均减少了26.7高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。 3.3用于啤酒外加酶法糖化 啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～1.6糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～1.6糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～1.4和α～1.6糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。 总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。 研究目的和意义： 酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。 其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。 研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集; (2)菌种初筛; (3)菌种复筛; (4)菌种保藏方法; (5)酶活力测定方法的建立。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响; (2)初始PH对发酵产酶的影响; (3)接种量对发酵产酶的影响; (4)发酵温度对产酶的影响; (5)金属离子对产酶的影响。 重点或关键技术： (1)纯菌株的分离; (2)菌株的鉴定方法的选择。 研究方法、手段： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样 (2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。 (3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。 (4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。 (5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。) (2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。) (3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%， 10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。) (4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。 (5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。) 研究进度 ：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。 ：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。 ：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。 2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。 文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等) 自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌Klebsiella.pneumoniae)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从0.069u/mL提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和4.5，具有一定的耐热和耐酸特性。 陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值4.0，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达350.8U/mL，最佳发酵条件下产量可达504.5-510.1U/mL .酶的最适作用温度为600C，最适pH值4.5，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。 技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到B.subtilis中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到B.subtilu:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在E.coli中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到E.coli中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。 主要参考文献： [1][美]惠斯特勒等编王雏文等译.淀粉的化学与工艺学[M].北京：中国食品出版社，1988 [2]张树政.酶制剂工业[M]. 北京: 科学出版社，1998 [3]邬显章.酶的工业生产技术[M]. 吉林: 吉林科学技术出版社，1988 [4]Taniguchi H, Sakano Y, Ohnishi M, Okada G(1985) Pullulanase[J].TanpakushitsuKakusan Koso. 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