医学生物工程的创新研究论文

生物的基因工程简述一种重组蛋白的性质；用途；重组菌的构建过程；生产方法与市场开发状况。选择（有意义的重组蛋白）: 人血清白蛋白性质： (1). 白蛋白的分子结构已于1975年阐明，为含585个氨基酸残基的单链多肽，分子量为66458，分子中含17个二硫键，不含有糖的组分。在体液pH7.4的环境中，白蛋白为负离子，每分子可以带有200个以上负电荷。它是血浆中很主要的载体，许多水溶性差的物质可以通过与白蛋白的结合而被运输。这些物质包括胆红素、长链脂肪酸（每分子可以结合4-6个分子）、胆汁酸盐、前列腺素、类固醇激素、金属离子（如Cu2+、Ni2+、Ca2+）药物（如阿司匹林、青霉素等）。用途：（1），它是从人的血液里分离出来的，作用是补充白蛋白，提高抵抗力，改善刀口愈合能力等，主要是用于低蛋白血症，如低蛋白的癌症病人 大手术后的病人，长期进食不好的病人。 （2），白蛋白是肝脏合成的，因此血清白蛋白浓度可以反映肝脏的功能，同时血清白蛋白水平的改变能导致一系列的病理性继发症，因此，测定血清白蛋白常用于病人状态的非特异监视。1、维持血液渗透压 白蛋白占全部血浆蛋白的50%以上。保持血液系统内的血浆胶体渗透压，调节组织与血管之间水的动力平衡，是维持渗透压的主要因素。正常人每100ml血液中白蛋白的含量为3.8～4.8克，但胶体渗透压中却有70～80%由白蛋白完成的，这是因为它分子小，分子量约6.9万，（多数血浆蛋分子量在16～18万之间），有效渗透颗粒较多。1克白蛋白产生的渗透压相当于20毫升液体血浆或40毫升全血所得到的血液动力学效应是相等的。2、运输和解毒作用白蛋白能与许多物质结合产生广泛可逆构形的改变。白蛋白能结合阳离子，也能结合阴离子，所以白蛋白能输送许多性能不同的物质，如脂肪酸、激素、微量金属离子、酶、维生素和药物等。许多在水中微溶的物质，在血浆中或白蛋白溶液中则为易溶，事实上溶解物是与白蛋白结合而成的复合物。白蛋白这种结合功能有助于微溶的代谢物运输。除此之外，白蛋白并能结合有毒物质，运送至解毒器官，然后排出体外。3、抗休克作用白蛋白能增加血液的有效循环量，对于失血、创伤、手术或烧伤所致的各种休克，均有明显疗效。4、营养作用组织蛋白质和血浆蛋白质存在着动力平衡，可以互相转化，在氮代谢发生障碍时，白蛋白可作为机体内的氮源，为各种组织提供蛋白营养。白蛋白还能促进肝细胞的修复和再生。5、20～25%白蛋白液体是高渗液体，能调节由于胶体渗透压紊乱而引起的机能障碍，如浮肿、腹水。输入白蛋白液后能使浮肿消退和腹水减轻、利尿。对防止和减轻脑组织的水肿亦有显著的疗效。构建过程：生产方法：1 重组入血清白蛋白在细菌中的表达用于表达人血清白蛋白的细菌主要有大肠杆菌和枯草杆菌。早在8O年代初期，Richard M等人便从事这方面的研究，从活体或尸体的冻存肝脏中分离出人血清白蛋白RMA，重组的质粒包含有成熟人血清白蛋白编码区的基因，由大肠杆菌的trP启动于——操纵子来控制质粒合成人血清白蛋白，DNA序列表达的蛋白是含前面带有24个氨基酸前体肽的585个氨基酸的蛋白质。Martine Latta 等人于 80年代后期也用大肠杆菌表达人血清白蛋白，从肝脏分离人血清白蛋白RNA加上PolyA来组建cDNA文库，分离获得的cDNA包含有成熟人血清白蛋白的编码序列和表达质粒PXL276，用PL启动子代替trP启动子，同时在一些位点插入一些片段，构建了大肠杆菌中比较有效的细菌表达系统，菌株以 LB培养基培养，用声裂法破碎细胞，再进行提取、重新天然化及提纯，获得了甲硫氨一HSA（MET－HSA），MET－HSA重新天然化及提纯后，与天然的人血清白蛋白非常相似。用大肠杆菌表达人重组血清白蛋白，虽然取得一些结果，有报道称，人血清白蛋白在大肠杆菌中表达量为细胞蛋白的7％，但用此法未能得到具生物活性的蛋白。枯草杆菌作为可表达异种蛋白的细菌中的一类，也被用来表达重组人血清白蛋白，将表达人血清白蛋白的结构基因与信号序列的编码区域融合在一起，可以在枯草杆菌中合成人血清白蛋白，但是，另一项研究表明，当人血清白蛋白表达水平低时，信号肽可以有效地被除去，一旦表达水平高时，信号肽的除去率便低，因此用此法无法进行人血清白蛋白高效表达。2 重组入血清白蛋白在真菌中的表达现在常用来表达人血清白蛋白的真菌主要是酵母，常用的有啤酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae）、乳酸克鲁维酵母（Kluyromyces Lactis）和毕赤酵母（Pichia Pastoris）。2．1 啤酒酵母用啤酒酵母表达重组人血清白蛋白是近期研究较多的课题之一。 D.SleeP等人证明啤酒酵母可以表达人血清白蛋白并可将其分泌到培养介质中，采用5种不同的引导序列，即质粒pAYE176、pAYE239、pAYE227、pAYE264和pAYE283，经过DNA合成，克隆反应，转化，DNA纯化及酵母培养，用聚丙烯酸胺凝胶电泳及。Western杂交来进行蛋白质的检测，其结果为；pAYE283和pAYE239引导的系统人血清白蛋白的表达量最高，为55mg／L。实验结果表明,引导序列的选择及与结构蛋白的关系是获得成功的关键。Miklos Kalman等用啤酒酵母表达人血清白蛋白，摇瓶实验表明其表达量可达1Omg／L。Quirk AV等人将啤酒酵母产生的重组人血清白蛋白与血浆中提取的人血清白蛋白通过一系列的分析技术进行比较，结果两种蛋白质的结构一致。此外，Kang HA等人还探讨了啤酒酵母表达的重组人血清白蛋白的蛋白水解的稳定性，其结果表明，啤酒酵母分泌的人血清白蛋白对PH依赖的蛋白水解介质非常敏感，介质成分的含量对其有影响。2．2 乳酸克鲁维酵母乳酸克鲁维酵母是另一种表达重组人血清白蛋白量较多的酵母。R. Fleer等人于90年代初期研究了乳酸克鲁维酵母高浓度分泌重组人血清白蛋白的稳定性多拷贝载体，使用的载体为pKD1，用克鲁维酵母／pKD1表达系统，重组人血清白蛋白的分泌水平在摇瓶培养时为40Omg／L。Saliola M等人于1999年用KIADH4启动子，用乙醇诱导，使乳酸克鲁维酵母表达重组人血清白蛋白。KIADH4是乳酸克鲁维酵母中编码线粒体乙醇脱氢酶的基因，乙醇可激活乙醇脱氧酶的活性。KIADH4启动子可用于乳酸克鲁维酵母中异常蛋白的表达。其研究结果表明，在KIADH4启动子的控制下，乙醇激活乳酸克鲁维酵母中的细菌卜葡萄糖音酸和人血清白蛋白基因，以乙醇为碳源，人血清白蛋白的产量提高，介于0.3g／L～1g／L之间。2．3 毕赤酵母毕赤酵母是近10年发展起来的真核表达系统，是现今比较令人满意的表达系统，经高密度培养，可获得高表达的重组人血清白蛋白，而且其它杂蛋白很少，有利于纯化。毕赤酵母属于甲醇酵母，可以甲醇作为单一碳源和能源物质。美国和日本的两大公司均是利用这一系统来进行重组人血清白蛋白的生产，其表达水平分别为5g／L和7g／L。邱荣德等对构建的毕赤酵母工程菌进行表达条件的优化，将摇瓶中表达重组人血清白蛋白的量提高到150mg／L。由于毕赤酵母是现今表达重组人血清白蛋白水平最高的系统，许多实验室从不同的角度对毕赤酵母表达的重组人血清白蛋白进行了研究。Ohtani W等人于1997年研究了毕赤酵母表达的重组人血清白蛋白的结构，结果表明，rHS完全氨基酸成分，末端序列和完全的氨基酸序列与cDNA推导的初始结构一致。重组人血清白蛋白的CD光谱在形状和强度上与血浆人血清白蛋白一致。人血清白蛋白的二硫化键的结构是非常重要的，它包含35个半胱氨酸残基， Ikeyaya等人应用气相蛋白质序列的方法来检测纯化的重组人血清白蛋白多-二硫键的性质。其结果表明：重组人血清白蛋白的流基成分与血浆人血清白蛋白是一样的。结构分析结果提示，提纯后的重组人血清白蛋白与血浆人血清白蛋白有相同的结构，而且，与血浆人血清白蛋白相比没有新抗原，临床研究也证明了重组人血清白蛋白是有效而且安全的。用真菌表达人血清白蛋白的方法比较成熟，表达量也比较高，但是，在临床上对人血清白蛋白的纯度要求比较高，所以在后期纯化上仍有许多问题需要进一步解决；而且，一旦进入产业化，人血清白蛋白的表达量势必要降低许多，这些都是需要考虑的问题。3 重组人血清白蛋白在植物中的表达用转基因植物生产重组疫苗，经过许多研究者的研究已成为可能。Sijimons等人于199O年将人血清白蛋白基因导入土豆和烟草中，以改装的CaMV355为启动子，生成了转基因土豆和转基因烟草。结果表明，两种转基因植物的叶子中均含有人血清白蛋白，这表明，用转基因植物生产重组人血清白蛋白已有可能。用植物大量生产外源蛋白比用动物细胞生产便宜，而且简单；但是，国内外研究者对转人血清白蛋白基因植物的研究很少，说明转基因植物生产入血清白蛋白仍存在许多问题。4 重组入血清白蛋白在动物中的表达转基因动物的乳腺生物反应器，由于其细胞能够将外源基因进行表达，提纯蛋白比较简单，而且可以提高产量，使药物蛋白的生产成本降低，许多研究者对其越来越有兴趣。用转基因动物生产人血清白蛋白，已有许多研究者对之进行研究。目前，做转基因小鼠的研究较多，其中最高表达量达35mg／ml。Shani M等人以绵羊 BLG为启动子，进行转重组人血清白蛋白基因小鼠的研究，结果表明，载体中包含有人血清白蛋白基因和内含子1、内含子2的转基因小鼠，在其奶中人血清白蛋白的表达水平为1～35mg／ml，此研究证实了转基因动物可以在奶中高效表达人血清白蛋白，在此过程中，内含子起了非常重要的作用。 HurVitz DR等人研究的转基因小鼠人血清白蛋白的表达量为10mg／ml；Barash Ⅰ等人研究的转基因小鼠人血清白蛋白的表达量为0.3mg／ml。此外，Pieper、Perraud、Baruch、Ⅰlan以及苟德明等均进行了转入血清白蛋白小鼠的研究，也获得了阳性表达的小鼠。1999年3月，上海医学遗传研究所在国际上首次成功地培育了一头转基因试管牛，其身上携带有人血清白蛋白基因，这一成果为通过转基因动物途径大量生产人类所需的药物蛋白迈出了重要的一步。此外，美国 TraXenoGen公司也研究、开发了用转基因的鸡蛋生产入血清白蛋白。用转基因动物生产人血清白蛋白，一旦形成产业化，其前景是不可估量的，一是可以提高人血清白蛋白的产量，二是可以使纯化过程简单，从而极大地降低成本。但用此法仍存在着生产出的人血清白蛋白会携带某些动物病毒的潜在性，且此法正处于研究阶段，要进行产业化生产仍需要较长时间。市场的开发状况： （1）。目前国内，注射血清都是有一定危险性的，因为里面可能存在其他为杀死的病菌， 乙肝. 艾滋都有可能，但是几率很低的。(2)。现在中国这药奇缺！！很不好买，药店一定没有，只有大的生物制剂制药厂才有，现在好像只有医院能进，很多医院也进不到了，现在只有用血浆代替！(3). 由于各种血液传染病对人类造成的危害，血液的来源会越来越紧缺，传统的血浆提取方法将会受到制约，重组人血清白蛋白的方法有很多，各种方法均有其优、缺点，仍有许多需要解决的问题和困难。目前技术上比较成熟并已进入产业化的方法是毕赤酵母表达人血清白蛋白，而研究较多又具有发展前景的是转基因生物反应器。重组人血清白蛋白的生产将是具有前途的产业。

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