农杆菌转化法研究进展论文

Ti质粒与T-DNA几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），是农杆菌生长必需的物质。1. Ti质粒的结构 在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。tms由两个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）tmr由一个基因组成iptz：tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物，称为opines。它有三个成员：octopine=精氨酸与丙酮酸的缩合物Napaline=精氨酸与－酮戊二酸的缩合物Agropine=谷氨酸与二环糖的缩合物据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根癌农杆菌使用作为氮源及碳源。的整合机制：T-DNA的详细整合机制尚不清楚，但有几个环节是明确的：T-DNA切除由Vir区编码的特异性内切酶完成，分别在LB和RB的第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，并形成单链T-DNA。T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整合有关，而LB无关。T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列，但整合位点的特异性尚未确定。Ti质粒转化植物细胞1 . Ti质粒的改造有以下理由使天然的Ti质粒不能作为表达载体使用：a. 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。b. 有机碱的合成与T-DNA的转化无关，而且可能会影响植物细胞生长，因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除有机碱合成基因（tmt）c. Ti质粒约为200kb，重组操作非常苦难，也很难找到单一的酶切位点。d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子。 加入植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物细胞启动子及末端polyA化信号，加入多聚人工接头以利于外源基因的克隆。植物中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。2. 植物细胞转化的共整合系统T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含有的选择标记和植物选择标记Kmr。首先在中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kmr筛选转化细胞。3 . 植物细胞转化的双元系统T-DNA转化植物细胞的标准方法是双元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。改良植物性状基因克隆技术提供了一种新的改良植物的方法，它可以直接的改变植物的基因型。有两种策略可以应用。1） 基因附加：通过添加1个或多个基因改变植物的性状。2） 基因扣除：利用基因工程技术使一个或多个植物已经存在的基因失活。灭活植物基因是通过反义技术来实现的。将外源基因反向的连接到载体中，当基因转录成mRNA后，与正常的mRNA是反向互补的。我们称这种反向互补为反义RNA，缩写为asRNA。反义RNA阻止原有基因表达的机理尚不明了，但可以肯定，正义和反义RNA之间的杂交与这一事件有关，可能双链的RNA很快被核酸酶降解 ，或者反义RNA阻止了核糖体与正义RNA的结合。

​Agrobacterium -mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi Abstract 农杆菌 Agrobacterium tumefaciens 可以将自己的部分DNA（transferred DNA；T-DNA）转移到很多种真菌中，这些可以用农杆菌介导转化（ Agrobacterium -mediated-transformation；AMT）的真菌数量仍在上涨。AMT为一些用传统方法难以对基因进行操作的真菌打开了一扇大门。文章讨论了农杆菌DNA转化系统在真菌诱变中的作用。 Introduction 酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）是第一个测定了全基因组的真菌，其研究和工具发展的很多很快，比如基因功能注释，转录情况分析，蛋白质二维凝胶分析，质谱等。然而对于丝状真菌，对于每一个预测基因的系统的突变分析，无论是定向诱变还是随机诱变都很困难。 与酵母菌不同的是，丝状真菌定向诱变需要构建基因互换盒（gene disruptioncassettes），且两侧有较长的同源区域（>1,000bp）才行。目前构建所需基因盒的方法有很多，各有优缺点。1995年，Bundock等人将应用于植物细胞的农杆菌使用在了真菌上，后来很多研究证明AMT可以用在很多不同的真菌上，与传统的真菌原生质体转化法相比，AMT可以利用孢子，菌丝体等作为开始材料，不需要制备原生质体，且更加高效。 Basics of AMT 农杆菌是植物病原菌，造成植物冠瘿瘤。致病机理是将200kbp的Ti质粒上上一段T-DNA转移到植物，T-DNA整合到植物基因组，指导合成一些酶，调节植物生长代谢。 Ti质粒上还包含一些segment，叫做virulence region，这个区域由许多致瘤性 vir 基因组成。Virulence region编码的蛋白质也参与了T-DNA的形成，转运和整合。 T-DNA两侧有24bp的重复序列，它是DNA运输到植物细胞体系的顺式作用信号。然而T-DNA的其他部分可以被删除或被替代，而不影响片段的转运能力。 农杆菌的这些特质发展出了现在用于转化植物和真菌的二元载体系统（binary vectorsystem）。在这个系统中T-DNA和virulence region分别存在于两个质粒里，含有virulence region的质粒叫做helper plasmid或disarmed plasmid，保留在农杆菌里。含有T-DNA的质粒在中，便于研究人员操纵。构建好带有T-DNA的质粒后，可由电击法等方法将质粒送入农杆菌中。 自然条件下，植物分泌的酚化物质或糖诱导农杆菌启动致病途径，诱导 vir 基因编码T-DNA转运机器，其双组分调节系统（two-component regulatorysystem）包括virulence proteins VirA和VirG，这两个蛋白激活对丁香酮（acetosyringone，AS）的识别并开始一系列反应。研究发现，农杆菌对真菌进行转化时，需要丁香酮存在才可成功，所以对真菌转化依然依赖农杆菌的virulence region。不过针对植物，酵母，丝状真菌的农杆菌转化的关键蛋白有一些差异。 当然寄主中的蛋白也会对农杆菌介导效率产生影响，所以不同真菌株系的转化效率也不一样。 Factors influencing AMT efficiency infungi 初始真菌材料 前面虽然提高农杆菌转化的一个好处是避免使用原生质体，然而对于一些真菌，仍然是原生质体的效率更高。不同真菌不一样，有的是分生孢子，有的是营养菌丝效率更高。而且越年轻的菌丝体，越有活力，转化效率越高。 农杆菌和寄主 不同农杆菌与不同寄主株系的组合都可能产生不同的转化效率。 AS使用 真菌与农杆菌共培养时，添加AS是必需的，AS可以诱发 vir 基因工作。AS在500μM浓度时效率很好，有时在单独培养农杆菌时也加入AS对转化效率提高有帮助，但是农杆菌用AS预处理对有些菌的转化甚至有反作用，比如 Beauveria bassiana ,  Fusariumoxysporum , 和  Magnaporthe grisea 。 共培养条件 包括温度（22-25℃最好），pH（），两者加入的比例，滤纸类型。有研究表明，不同真菌与农杆菌的浓度配比，应与真菌生长速率与对农杆菌的敏感度有关。 顽强的真菌 由于人类对T-DNA转运机制理解仍然有限，有一些顽强的真菌不可以用农杆菌转化的方法操控。目前还没有解决的方法。综述在后面举了一些真菌应用农杆菌转化法成功产生突变体的成功案例。并且讨论了与传统CaCl2/PEG原生质体转化方法的效率比较，农杆菌介导的普遍比原生质体转化法效率高，基因位置对转化率也有影响。参考文献 Michielse, , ., van den Hondel, ., and Ram, . (2005)Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics infungi.  Current genetics   48 : 1-17.