多参数监护仪的检测论文

FLAER多参数检测PNH克隆的影响论文

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种获得性克隆性造血干细胞疾病，其发病机制主要是由于体细胞X染色体上的PIG-A基因突变，导致血细胞膜表面糖化磷脂酰肌醇(GPI)锚合成障碍，锚连接蛋白缺失。传统的诊断方法主要有蔗糖溶血试验、酸溶血试验、尿含铁血黄素试验，但这些方法敏感性、特异性差。近些年来，通过流式细胞仪检测CD55、CD59已经成为诊断PNH的常规方法，特别是CD59，其敏感性高于CD55，在PNH 诊断过程中被认为是一个优于CD55 的指标。荧光标记的无活性嗜水气单胞菌溶素前体的变异体(FLAER)可以特异性的与GPI锚连蛋白结合，经流式细胞仪检测，其特异性和敏感性较传统方法更好。PNH、再生障碍性贫血(AA)和骨髓增生异常综合征(MDS)均为骨髓衰竭性疾病，具有相似的发病机制和临床表现，早期鉴别诊断常很困难。本文联合FLAER、CD45、CD15、CD24 多参数检测粒细胞PNH克隆以及CD59检测红细胞PNH 克隆，旨在有效提高PNH克隆检测的敏感性、特异性，有助于骨髓衰竭性疾病的早期鉴别诊断，现报道如下。

1 资料与方法

一般资料 所有病例均来自于本院血液科连续48例住院患者。其中PNH患者9例，AA患者13例，诊断均符合血液病诊断及疗效标准;MDS患者11例，符合2008年WHO诊断分型标准。对照组15例均为巨幼细胞性贫血患者。

仪器与试剂 FACSAria型流式细胞仪，溶血素、磷酸盐缓冲液(PBS)和CD59、CD45、CD15、CD24试剂和均购自BD公司，FLAER试剂购自加拿大Protox Biotech公司。

方法

外周血红细胞CD59检测 取EDTA 抗凝全血100μL，经PBS洗涤后稀释于的PBS中，取100μL加入CD59-PE单抗20μL，4℃避光孵育30min后，1 000r/min离心5min，弃上清，用2mL PBS液洗涤2遍，重悬于1mL PBS液中上机检测，用流式细胞仪测定CD59细胞的表达率。

外周血粒细胞FLAER检测 取EDTA抗凝全血100μL，加入CD45、CD15、CD24、FlAER抗体各20μL，避光孵育30min后，加入2mL溶血素，室温下避光10min，溶血完全后1 000r/min离心5min，弃上清，用2mL PBS液洗涤2遍，重新悬于500μL的PBS液中液上机检测，用流式细胞仪测定FLAER的表达率。

统计学处理 采用软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验和Mann-Whitney U 检验，P<为差异有统计学意义。

2 结果

临床特征 PNH患者9例，男6例、女3例，年龄16～60岁，中位年龄30岁;AA患者13例，男5例、女8例，年龄7～63岁，中位年龄38;MDS患者11例，男5例、女6例，年龄41～72岁，中位年龄53岁，其中RCMD 1例，RCUD 6例，RAEB-Ⅰ2例RAEB-Ⅱ1例，5q-综合征1例;对照组15例，男6例、女9例，年龄19～61岁，中位年龄34岁。

不同方法对PNH 患者检测的比较 PNH 组患者FLAER缺失率和CD59缺失率分别为(±)%和(±)%，显著高于对照组、AA组、MDS组，差异有统计学意义(P<)。FLAER检测结果明显高于CD59检测，差异有统计学意义(P<)。其中，有2例患者，一例CD59缺失率为，FLAER缺失率为;另一例CD59缺失率为，FLAER缺失率为。

不同方法对非PNH 患者检测的比较 各组中FLAER缺失率平均值均大于CD59缺失率，但差异无统计学意义(P>)，表明在非PNH组中FLAER和CD59检测无显著差异。对照组中FLAER缺失率为，特异性100%，有3例存在CD59缺失，缺失率均小于1%。13例AA 患者中5例检测出FLAER缺失，其中4例检测出CD59缺失，1例未检测出;11例MDS患者中3例检测出FLAER缺失，其中2例存在CD59缺失，1例CD59缺失率为0。结果说明FLAER检测比CD59检测更为敏感，特异性更好。

3 讨论

到目前为止，已经发现了20多种蛋白在PNH 患者血细胞表面表达缺乏，其中红细胞膜上衰变加速因子(CD55)和反应性溶血膜抑制物(CD59)的缺失被认为是引起PNH 病理生理的主要原因。红细胞数目多、抗体表达强是灵敏度检测最好的目标细胞。尤其是在一些粒细胞减少的疾病中如AA、MDS，红细胞检测尤为重要。同时，通过比较红细胞和白细胞的数值，可以给临床提供更多信息。CD55分子在红细胞上表达较低，而CD59分子的荧光染色强且均一，近些年来已成为PNH诊断的“金标准”。然而，越来越多的研究发现检测红细胞CD59表达对PNH 的诊断有一定的局限性。

本研究发现，在PNH组的两例患者中，一例CD59缺失率为，另一例CD59缺失率为，而FLAER缺失率分别为和。可能是由于患者正处于疾病的活动期，接受输血治疗，影响了红细胞CD59的表达，导致CD59表达出现假阳性。有研究表明，在小细胞低色素性贫血时，病人的红细胞膜表面的CD59表达均有降低，但粒细胞是正常的，若只检测红细胞的CD59会造成其表达假阴性。此外，正常细胞衰老时表面分子CD59还有可能自发丢失，均可导致检测值偏离事实。随着技术不断进步，人们研究出了FLAER 技术，FLAER是Alexa-488标记的无活性的嗜水气单胞菌溶素前体的变异体，可以特异性地与GPI锚链蛋白结合，在所有具有GPI锚连蛋白的粒细胞上均有特异性表达，不会因不同细胞表达GPI锚链蛋白的多少和种类不同造成误差。由于FLAER能直接检测GPI蛋白，有助于识别真正的PNH 和免疫性血细胞减少症，明确真正的GPI阴性细胞。本研究中对照组FLAER检测缺失率均为0，与CD59相比检验结果更具有特异性;在PNH组中，FLAER的缺失率显著高于CD59，敏感性更高。FLAER也是防止门内出现污染细胞最好的抗体。如果门内污染了少量的.CD24阴性表达的细胞群，可能会被误认为是小的PNH 克隆，而FLAER 与CD24一起使用可以提高PNH检测的准确性，CD24/FLAER双阴性细胞群才是真正PNH克隆细胞群。FLAER多参数检测要求外周血标本采集后必需及时送检，否则会导致粒细胞存活率下降，细胞非特异性染色增强，影响检测效果。这在一定程度上影响了FLAER在临床上的应用。PNH 克隆的检出对于MDS和AA的临床表现、治疗及转归有重要意义。部分具有PNH 克隆的AA患者对免疫治疗效果更好，即使小于的克隆也会影响治疗效果。

对于检测出少量PNH克隆的AA患者，需监测PNH克隆数的变化，因为患者有可能发展为溶血性贫血。在本研究中，PNH 与MDS的关系只局限在低危MDS中，表现为血细胞减少，骨髓增生低下;遗传学异常发生率低，临床过程惰性进展，更多地表现为骨髓衰竭的特点。AA 组、MDS 组中FLAER的缺失率均大于CD59的缺失率。由于AA和低增生性MDS的鉴别十分困难，但到目前为止还没有报道MDS的患者进展为PNH，监测PNH 克隆对于这两种疾病的鉴别具有一定的意义。AA、MDS患者中检测出的PNH 克隆常常很小，CD59检测不易测出。在这两组中各有1例患者CD59缺失率为0，而FLAER表达均有缺失，缺失率分别为、。FLAER检测更敏感，与CD59相比灵敏度更高。由于AA、低增生性MDS和PNH 均属于骨髓衰竭性疾病，具有相似的发病机制、临床表现和生物学特性，三种疾病之间的鉴别很困难。FLAER检测与CD59相比灵敏性和特异性更高。能够早期提供更为灵敏、特异的PNH 克隆依据，在临床症状不典型、诊断不明确的疑似PNH患者，辅以FLAER检测有助于早期确诊或除外诊断。因此，FLAER高灵敏度检测PNH 克隆对这三种疾病及疾病之间的诊断鉴别及了解临床过程、预后及转归具有一定的意义。

duō cān shù jiān hù yí

该便携式微电脑参数生理监护仪，检测参数多，设计紧凑，体积小巧，携带方便，既可用于病房，也可用于室外，可以定时、连续、长时间地检测病人的重要生命特征参数，它在保障病人的生命安全方面具有重要的临床使用价值。

便携式微电脑多参数生理监护仪的主机由两个16位微控制器80C196组成。

系统通过信号检测与预处理模块将生物医学信号转换成电信号，并进行干扰抑制、信号滤波和放大等预处理。然后，通过数据提取与处理模块进行采样、量化，并对各参数进行计算分析，结果与设定阈值比较，进行监督报警，将结果数据实时存储到RAM，并可实时传送至PC机上，在PC机上可实时显示各参数值。

系统原理框图如图1所示。该监护仪由两个单片机组成双CPU系统。

单片机1完成对体温、心电波形、脉搏脉形的信号检测、处理、数据存储，并通过LCD显示屏对各波形、参数进行定时显示、报警。

单片机2承担其中耗时较长的血压测量及血氧饱和度的检测，使之不影响整个系统的正常工作，同时还承担对心率、呼吸频率的测定。

两个单片机间的信息交换通过1个8位的并行口进行，由2根I/O口实现通信控制。具体是用P1口，配合两个高速输入、输出I/O口（、），用作两个单片机之间的数据传送。这种双机间的连续方式属于松耦合的多处理机系统（参考文献8），在硬件实现上较为简单，只需在软件编程时，为其通信方式设计必要的通信协议、数据传输方式等。

（1）系统采用EEPROM 28C64作为程序存储器；采用一片非易失性静态存储器（NASRAM）作为数据存储器。NASRAM具有静态存储器的优点，同时具有非易失性的特点。非易失性的特点是指存储芯片在掉电的情况下，能够正确无误地保存所有数据，保存时间长达10年。采用芯片的非易失性的特点可以不用为此芯片提供掉电备用电源，即可实现掉电数据保护。

（2）液晶显示模块

为了对心电波形、脉搏波形及其它生理参数进行显示，而且对波形显示具有足够的分辨率，为此系统采用图形液晶显示屏。为了减少仪器的体积，实现系统低成本，功耗小的要求，选用了特别适用于便携式监护仪的单色LCD显示屏。

该显示屏为日立LMG70520XNGR液晶显示屏，点阵数为640×200，点尺寸为×，其驱动电源为+5V和20～21V,耗电仅8mW，能满足本系统的要求。

为控制该显示屏的显示，我们选取了适用于该显示屏的显示控制器SED1330。该芯片是用于计算机的指令与数据，并产生相应的时序及数据控制液晶显示屏的显示。该控制器自带RAM，自行管理显示缓冲区，与CPU之间通过8位数据并行传输，与显示屏之间是4位数据并行传输。

（3）键盘输入模块

系统设计的功能键采用中断方式输入。当有任一功能键按下时，产生键盘中断，CPU执行中断程序，读取键码，执行相应操作；没有键按下时，不占用CPU的运行时间，提高了CPU的运行效率。

键盘采用两片74LS373构成矩阵软件编码键盘，键盘部分直接挂在单片机1的总线上。不占用单片机I/O口线，也不必为此扩展系统I/O口，可减少系统消耗功率。

通过为键盘分配相应的I/O地址，可采用读写该地址的方式获得键码。硬件实现简单，软件编程方便。

（4）电源系统

基于低功耗和便于携带使用的考虑，系统采用电池供电及外接ACDC变换器件供电的方式。设计采用三节电池供电。该电压通过稳压器件提供+5V的电压给系统工作。同时采用DCDC电压变换器+5V的电压变换至18～24V电压，以提供给LCD显示屏工作。

选择电池作为电源是基于如下考虑：具有高输出能力、小型结构、标准尺寸和低价格。

（5）外围器件控制

系统各外围器件的片选信号由74LS373锁存的地址信号，经芯片GAL16V8C译码产生。GAL芯片是可编程逻辑阵列，通过对其引脚的编程，将其作为译码器，依据P4口高字节8位地址进行片选，其编程方便，使用灵活。系统除用作译码器外，在单片机2中，还用作控制气泵和气阀的开关。

通过簇已分配给气泵或气阀I/O口地址，写上“0”或“1”，则输出引脚OUT1、OUT2为低或高电平。该电平将保持，直到再次往同一地址写“1”或“0”，如此，可定时控制气泵或气阀开关。

系统软件的主要特点是，以实时数据为核心，以功能独立化、结构模块化为软件设计模式。系统开发采用了结构化的，从上到下的模块划分及从底到上的硬件功能封装的软件开发设计方法。本系统采用C96语言进行软件系统开发。

（1）数据采集程序

数据采集到整个系统最重要的问题。如何实现数据采集，保证数据采集的实时性，并且能高效率地进行数据采集，尽可能少的时间占用少的系统资源，对于多参数同时监护的情况下，是确保系统处理的实时性的重要因素。

在软件设计中，我们利用硬件定时器及软件定时器，进行定时中断，进行多通道、多采样点的数据采集流程设计。由于人体生理信号的变化较缓慢，采用此种方法已经可以确保高精度、实时性的数据采集。

（2）液晶显示控制

系统显示功能的实现，实际上是对显示控制器SED1330的编程控制。SED1330控制器具有系统控制、显示操作、绘制操作、存储操作等共15条指令。

在进行系统显示模块的编程时，我们利用C96语言对SED1330的指令功能进行分类组合、封装，编制了一个基本的显示控制图函数库。通过对子函数的调用，非常方便地实现了复杂的人机界面程序设计。

设计的子函数如下：

lnitCD(); /*初始化SED1330*/

ClearDispBufffer(); /*对显示缓存区清零*/

ChooseScreen(screen); /*选择显示缓存区*/

SetCsrAbsAddr(addr); /*设置光标绝对位置*/

SetCsrDir(dir); /*设置光标移动方向*/

PutChar16xy(x,y,data); /*显示点阵为16×16的字体*/

SetPutPixel(x,y)； /*在显示屏上显示一点*/

H_line(x1,x2,y,linestyle); /*画水平线*/

V_line(x1,y1,x2,y2); /*画垂直线*/

lnvert(x1,y1,x2,y2); /*对矩形区域反显*/

Clear(left,top,right,bottom); /*清除矩形区域*/

部分液晶显示子程序示例如下：

# include

# include “”

# include

# define UP 0x4e

# define DOWN 0x4f

# define LEFT 0x4d

# define RIGHT 0x4c

# define AP 80

# define SA1 0

# define SAD2 0x3e80

# define Max_X 640

# define Max_Y 200

# define ECQ_Y 128

# define PLUSE_Y 50

# define NORMAL ox4f

# define DOT_1 0xaa

# define DOT_2 0x66

unsigned char * m_reg;

unsigned char * pram_reg;

unsigned int_sad;

/************************/

/* var screensvalue is:1 or 2.*/

ChooseScreen(screen)

Unsigned char screen;

{

switch(screen){

case 1:

_sadSAD1;break;

case 2:

_sadSAD2;break;

defaulf:

_sadSAD1;}

}

/*************************/

lnitl_CD()

{

* m_reg0x40; /*SYSTEM SET */

* pram_reg0x34;/P1 CGRAM font dot array(now is:8x16)*/

* pram_reg0x87; /*P2 */

* pram_reg0x07;

* pram_reg80;

* pram_reg93; /*P5 93 */

* pram_reg200;

* pram_reg80; /*P7 */

* pram_reg0; /*P8 */

* m_reg0x44; /*SetSooll() */

/*set SAD1 */

* pram_reg0x0; /*P1 */

* pram_reg200; /*P3 */

/* set SAD2 */

* pram_reg0x80; /*P4 */

* pram_reg0x3e;

* pram_reg200; /*P6 */

/*set SAD3 */

* pram_reg0x00; /*P7 */

* pram_reg0x7d; /*P8 */

/*set SAD4 */

┆

* m_reg0xf58; /*Set Display(OFF)*/

/* *pram_reg0; */

* m_reg0x5d; /*SetCsrForm()*/

* pram_reg6;

* pram_reg0x86;

* m_reg0x5a; /*set HDOT SCR*/

* pram_reg0; /*must be clear*/

* m_reg0x4c; /*set csr dis is:RIGHT*/

* m_reg0x5b; /*SetOvlay */

* pram_reg0x1c; /*three graphics display zone*/

* m_reg0x5c; /*SetCGRAM(addr)*/

* pram_reg0xf0; /*turn off the CGAM */

* pram_reg0;

* m_reg0x59; /*SetDisplay(ON)*/

* pram_reg0x16;

ClearDispBuffer();

}

………………

利用LCD显示屏进行显示时，需要解决的问题是清除图形间断现象。模拟波形是连续图形，但显示屏是以离散点加以显示的，这样会造成波形快速升降沿间断的现象。

为此，我们设计了一比较子程序。当相邻两列的点的幅值差大于2时，就将两点间的所有点“点亮”，使显示的图形连续。

（3）中断系统的应用

本系统功能的实现，主要由中断程序程序实现。如采用键盘输入中断、数据采集中断、双机通信、上下位机间的通信等中断服务。中断服务在整个系统软件中起著不可缺少的作用。

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