强制性免疫知网论文

国家对一些传染性疾病实行强制免疫，旨在控制疾病的传播，保障公共卫生安全。这些疾病通常具有较高的传染性和致死率，如麻疹、白喉、破伤风、肝炎等。强制免疫可以有效地提高人群的免疫力，防止疾病的传播，保护个人和公共卫生安全。建立免疫档案的意义在于，能够记录个人的免疫情况，包括接种的疫苗类型、时间和剂次等信息。这有助于医生和公共卫生工作者对疾病的预防和控制进行更加精确的管理和跟踪，也能够为个人提供更好的健康保障。同时，免疫档案也可以作为个人就业、入学、出国等需要提供免疫证明的情况下的重要证明文件。

免疫学的发展是人们在实践中不断探索、不断总结和不断创新的结果。下面我给大家分享一些免疫学技术论文，大家快来跟我一起欣赏吧。

心理神经免疫学研究

摘要心理神经免疫学(Psychoneuroimmunology)是一门探索人类心身健康奥秘的新型边缘学科。它研究神经系统如何将心理因素转换为可以影响健康的生理状态的机制，特别是脑和行为如何影响免疫系统，又如何受到免疫系统的影响的。免疫系统和神经系统之间是否真正存在联系一直有争论，我们实验室围绕高级神经活动对免疫系统的作用开展了研究。工作包括：条件反射性免疫抑制和增强、情绪应激与免疫、心理行为干预与癌症等。这些工作不仅证实了心理调控，比如信号刺激、情绪和意念想象等，确实可以影响免疫系统的功能，而且对有关机制进行了探讨。

关键词心理神经免疫学，条件反射性免疫，情绪应激，心理行为干预。

分类号B845

有人统计，人类疾病有2/3与心理刺激、生活境遇有关，其中心身疾病占1/3。实际上，心理因素可以影响生理因素的观点是各国文化群体都普遍认可的。也就是说，精神和躯体之间是互相联系的。然而心理因素如何影响健康和疾病却一直是个谜。随着科学的发展，一门新兴交叉型边缘学科，心理神经免疫学(Psychoneuro- immunology)诞生了。它融合了心理学、生物化学、免疫学、行为学、解剖学、分子生物学和临床医学等多种学科，研究神经系统如何将心理因素转换为可以影响健康的生理状态的机制，特别是脑和行为如何影响免疫系统，又如何受到免疫系统的影响的。这些研究对认识精神活动在健康和疾病中的作用打开了科学之窗。人们看到了免疫系统，这一保护机体免受传染病和肿瘤侵袭的防御系统，是精神和躯体之间的桥梁[1,2]。但是，尽管已经有很多研究表明神经系统可以影响免疫系统，依然有不少生理学家认为免疫系统是独立的自我调节系统。实际上这涉及一个由来已久的争议问题，即心身分离还是心身交互作用的问题。本文的目的就是依据我们自己的工作，阐明心理行为因素在调节免疫功能中的作用及其相应的机制。这些工作包括了条件反射性免疫抑制和增强、情绪应激的免疫效应、心理行为干预与癌症等。

1心理神经免疫调节的研究

条件反射性免疫抑制和增强

条件反射性免疫是中枢神经系统调节免疫系统的重要证据。自从Ader和Cohen在1975年第一次发表关于条件反射性免疫抑制(conditioned immunosuppression, CIS)的工作以来，这一实验范式得到了广泛的关注。在这种实验范式中，一种对于实验动物来说在味觉上新异的溶液，比如糖精水，被用作条件刺激(conditioned stimulus, CS)，而免疫抑制剂如环磷酰胺、环孢霉素A等具胃肠道毒副效应的药物作为非条件刺激(unconditioned stimulus, UCS)，二者配对呈现。随后再次给与条件刺激，则发现实验对象出现了条件性味觉厌恶的行为现象，而且免疫功能也受到了显著的抑制。针对这一现象的解释是有争议的。有的认为这是条件反射性的调节作用，是中枢神经系统调控免疫功能的重要证据之一。另一些则认为可能是应激的作用。动物对糖精水的厌恶行为也即味觉厌恶性条件反射的建立不能排除某种程度的应激的存在，而应激则会引起肾上腺皮质激素的升高，从而抑制免疫功能[3]。为弄清条件性免疫抑制的实质，我们分别采用一次性和两次性的CS-UCS结合训练方式，并在不同时程呈现条件刺激，观察由条件刺激引起的味觉厌恶性行为与条件反射性免疫抑制的关系，发现两者的表现方式和表现程度并不同步，条件反射性免疫抑制并非是厌恶行为反应或情绪应激的伴随产物 [3,4]。并进一步发现不具明显毒性作用的生物免疫抑制剂作为UCS时，也能建立条件性的免疫抑制效应[5]。条件刺激不仅可诱发动物的细胞免疫抑制反应而且可诱发体液免疫反应的抑制作用，并且随着强化水平的增加，条件反射性免疫抑制效应增强[6]。这些实验证明条件反射性免疫抑制是条件刺激的作用，而不是应激效应。对CIS的合理的解释是脑中CS―UCS的联想学习过程，中枢神经系统储存了对条件刺激(CS)的知觉信息，该条件刺激与UCS的免疫抑制反应相偶联，CS再次呈现时就产生一个直接信号激活免疫系统引起反应。

利用联想学习原理，条件反射性免疫调节应该是双向的。也就是说，条件刺激可以产生免疫抑制效应，也就可以产生免疫增强效应。建立起条件反射性免疫增强(conditioned immuno-enhancement, CIE)的模式将更有利于证明条件反射性免疫调节是中枢神经系统调控免疫系统的结果。而且由于CIE所用药物的免疫效应与CIS有所不同，CIE模式将为脑和免疫系统相互作用的研究提供新视角。为次，我们在国际上首次尝试以卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)抗原作为非条件刺激，糖精水作为条件刺激，经过一次配对，在初次抗体反应曲线的上升阶段再次单独呈现条件刺激时，诱导出条件反射性抗OVA抗体生成的增加[7]。虽然该条件性抗体增强的幅度较低，但从统计学上看，条件反射组和非条件反射组之间有了临界值差异。但该模式最初没有得到完全成功的验证[8]。为重复检验条件性抗体增强效应，再次分别用糖精水和电针作为条件刺激，进一步观察和分析条件性抗体增强的动态反应，对条件反射性抗体增强的发生发展过程做一完整的描述。

在用糖精水作为条件刺激的重复实验中[9]，不同于先前工作的是，再次单独呈现条件刺激的时间是放在初次抗体反应的下降段，而不是放在初次抗体反应曲线的上升段。这是考虑到在基础抗体值比较低时，条件反射本身的效应可能得到充分体现。而实验结果也证实了这一点。统计学数据表明，抗体水平在条件反射组和其他控制组之间的差异均达到了p<甚至的水平。

我们还发现，条件刺激诱发的抗体生成曲线在动力学上与抗原再次进入体内引起的二次抗体反应曲线很相似。单独给予条件刺激后约15天左右出现明显的抗OVA抗体水平增高，20、25天左右达到峰值，以后明显下降并逐渐接近正常水平[10]。这一结果不仅仅证明了联想学习可以调节免疫功能，而且发现了条件反射性免疫过程与抗原引发免疫应答过程的基本规律是类似的。这些工作从免疫增强的方向论证了信号刺激的免疫调节作用，建立了稳定可靠的CIE模型。

从临床角度出发，条件反射性免疫增强的重要意义在于通过脑的调控提高免疫力，增强机体对疾病的抵抗力。考虑到CIE模式在人类临床应用的可能性，寻找合适的条件刺激很重要。因为甜味饮料是人类日常生活中经常会遇到的，从新异性的角度考虑，糖精水或甜味饮料都不太适用于人类。因此尝试将一种躯体感觉信号――外周电针刺激――作为条件刺激，考察它能否诱发特异性抗体增强反应。 电刺激信号是通过两支刺入肌肉5mm的细钢针发送的。为了减少实验误差，选择传统医学中的穴位足三里作为针刺的位置，因此这种条件刺激物也可以称为电针。在这个研究中我们选择的电压强度分别为2伏特和4伏特[11]。

在本研究中，先是将电针刺激和腹腔注射OVA进行一次配对。经过一段时间的间隔，再次对动物实施电针。然后分别在第二次电针后的第10，17，24和31天经尾静脉取血，检测抗体值。结果发现，不管是2伏特还是4伏特的电针，均能显著提高抗体浓度，在第10和第17天时最为明显。研究还发现，甚至在麻醉状态下，电针和卵清白蛋白也可以实现配对，也就是说，在条件反射训练时麻醉的动物也出现了反射性抗体生成增加。没有发现电针本身对抗体生成有任何影响。这些结果进一步证实，仅需经过条件刺激和非条件刺激的一次配对，再次呈现的条件刺激即可诱发出条件反射性免疫反应。验证了条件反射性抗体增强的客观存在性和普遍性。而且，电针被用作为一个有效的条件刺激物，将为把条件反射性免疫调节在临床上得到应用提供了一种可能性。

条件反射性免疫调节的神经机制

条件反射性免疫抑制效应和免疫增强效应都表明与免疫无关的信号刺激能转变为具有触发免疫反应的非条件刺激的性质，这种转换必然发生在脑内，因而可以说这是脑对免疫系统调控的直接证据，但脑内究竟发生了什么并不清楚，条件反射性免疫调节的相关神经回路和脑机制还远远没有弄清[2]。为了直接洞察脑的变化，探讨脑内中枢整合机理，找寻直接观察脑内活动的指标是必要的。

C-fos蛋白是神经元激活的一个标志物。它通常处于不活动或表达很低的状态，但在受刺激时能作出短暂而迅速的反应，可成为神经元兴奋水平的客观指标。利用免疫组化技术，我们发现，再次单独呈现条件刺激可以导致包括脑干，边缘系统和大脑皮质在内的区域大量c-fos蛋白的表达。其中有一些脑区尤为重要。不论是条件性抑制范式还是条件性增强范式，再次单独呈现条件刺激都可以引起岛叶皮质、杏仁中央核和下丘脑室旁核c-fos蛋白的大量表达。这些结果表明，条件性免疫反应是和大脑的活动相关联的[10,12,13]。

但是必须指出的是，在我们和其他作者报道的关于脑机制的研究中，所采用的条件刺激物都是糖精水。我们的实验已经证实，以电针作为条件刺激也可以很好地诱发出条件性免疫改变，而电针和糖精水所激活的脑区是大不相同的，因此在今后的研究中阐明以电针为条件刺激所激活的大脑区域将有助于进一步确定与条件反射性免疫调节有关的共同脑机制，排除刺激引起的非特异性相关。

目前关于条件反射性免疫的神经化学机制研究也很缺乏。由于中枢胆碱能系统被认为与学习记忆有很密切的关系，该系统的这些功能主要是由毒蕈样受体(muscarinic receptor, M受体)介导的。为再次验证条件反射性免疫与学习过程有关，实验采用对M受体具有阻断作用的药物东莨菪碱作为工具药，考察整个M受体系统在条件反射性免疫调节中的作用。结果发现在以电针为条件刺激的条件反射性抗体增强模式的学习阶段是中枢胆碱能M受体依赖的，但在条件反射的唤起阶段是非胆碱能受体依赖的。在条件反射训练前阻断M受体，条件反射性免疫不再发生。但在条件反射训练完成后再抑制乙酰胆碱的合成，则不会影响条件刺激诱发的免疫反应。这些结果表明中枢乙酰胆碱参与了学习阶段的记忆形成过程，但不影响已经形成的记忆的再提取。这从神经生化的角度论证了条件反射性抗体生成的增加与学习记忆有关[14]。

2情绪应激与免疫

除条件反射性免疫的研究外，应激与免疫的研究是进行精神行为因素对免疫功能作用研究的另一热点[2]。已经有很多证据表明，应激可以导致免疫功能改变。但是，相关的动物研究大多采用电击或束缚的方式来引起应激效应。尽管这些模型也含有心理应激的成分，但其主要成分是生理性的。为了考察情绪应激对行为、神经内分泌和免疫功能的影响，研究采用两种情绪应激的动物模型：一种是传统的，以电击装置为信号刺激诱发曾有过电击经历大鼠的情绪应激。另一种是本实验室新建的，用空瓶刺激诱发定时喂水大鼠的情绪应激。这两种类型情绪应激源激活的脑区有许多共同点[15]。

在传统的电击信号刺激模式中[16]，动物分成4组：电击组、情绪应激组、装置对照组A1和装置对照组A2。电击组动物用OVA免疫后2周内无规律给予10分钟/日，共6日的足电击，其余时间内无处置;情绪应激组动物除给予电击组动物电击的当天同样强度和频率的足电击外，在2周内的其余时间将其每天置于电击装置内10分钟而无电击(恐惧的情绪应激);对照组A1动物仅在给予电击组动物电击的当天被置于电击装置中10分钟而无电击;对照组A2的动物则每天被置于电击装置中10分钟而无电击。结果发现情绪应激组动物的呆滞行为和排泄行为显著增加;去甲肾上腺素、肾上腺素及皮质酮水平均显著提高。在抗OVA 抗体水平和脾脏指数上， 情绪应激组动物较装置对照组A2动物显著降低，而其余各组间无显著差异。并发现脾脏指数分别与肾上腺素含量和去甲肾上腺素含量呈显著负相关。

在空瓶刺激诱发的情绪应激模式中[17]，动物先进行一周2次/日的定时饮水训练，然后腹腔注射OVA抗原以激发特异性抗体反应。此后动物被分成3组：分别为情绪应激组、生理应激组、和对照组。情绪应激组的动物每天只有一次饮水的机会，而另一次则给予一只空的饮水瓶，持续14天，以产生情绪应激。生理应激组的动物也是只有一次饮水的机会，但并不另外再给一次空瓶的刺激。这种设置的目的是控制缺水本身可能造成的生理应激的影响。对照组保持每天两次饮水不变。结果发现情绪应激产生了很显著的行为改变，即攻击行为和探究行为显著增加;血浆皮质酮、肾上腺素和去甲肾上腺素的水平显著提高;白细胞计数和抗OVA抗体浓度显著下降。抗体水平和脾脏的重量与儿茶酚胺水平之间均存在显著的负相关。但情绪应激的时间作用点和时程对应激的免疫效应有影响 。与此相对的是，缺水导致的生理应激只能诱发探究行为，升高皮质酮水平，降低白细胞计数。但它不诱发攻击行为，不影响抗体水平和脾脏指数，也不激活交感神经系统。这些结果进行了反复的验证 [18~20]。

上述两种模式的研究结果都证明，情绪应激对免疫功能产生了抑制效应，激活了下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)和交感神经系统(sympathetic nervous system, SNS)。由于抗体水平和脾脏指数与儿茶酚胺水平存在显著的负相关，而与皮质酮水平无关，提示交感神经系统的激活可能及情绪应激对体液免疫功能调节的中介机制。而皮质酮水平可能只是应激的一种反应。

为了进一步澄清HPA轴与SNS在情绪应激免疫调节中的作用 ，我们分别采用糖皮质激素合成抑制剂美替拉酮阻断HPA轴，外周交感神经末梢的6-OHDA损毁SNS的活动。结果发现，对SNS的阻断能消除情绪应激对体液免疫功能的抑制。而HPA轴的阻断没有这种作用。这些实验证明是交感神经系统介导了情绪应激所致的体液免疫抑制。进一步的证据是，非选择性β-肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor, β-ADR)拮抗剂心得安可以逆转情绪应激诱发的体液免疫抑制作用，表明SNS是通过b-ADR介导情绪应激导致的体液免疫功能的抑制。在此基础上，进一步发现参与的受体亚型是选择性的b2-ADR而非b1-ADR[21,22]。

尽管以往大多数研究者认为，应激引起的免疫功能抑制主要是因为应激可以导致肾上腺皮质激素的释放，从而导致免疫功能下降。换句话说，免疫功能的抑制与应激激活的HPA轴有关。但采用我们的情绪应激模型，发现情绪应激引起的体液免疫功能抑制主要是由交感神经系统β-肾上腺素能受体介导的。这为阐明情绪应激的免疫抑制效应的机理提供了新资料。

3心理行为干预与癌症

正如上述研究发现的，心理因素比如情绪或者条件性学习可以引起动物的行为和免疫功能的改变。我们考虑是否可以通过心理行为干预手段来影响癌症病人的免疫功能。虽然有研究报道，癌症可以通过将心理、情绪等多种因素整合起来影响病人的整个机体，但研究结果并不一致[23]。为此，我们打算通过两个研究来考察行为干预对于癌症病人的作用。纳入第一个研究的是40个正在接受放疗的乳腺癌患者，根据年龄、教育程度、癌症分期和接受治疗的状况，她们被随机而匹配地分成两个组：一组接受为期一个月的心理行为干预，另一组作为对照。首先指导干预组病人学会渐进性肌肉放松，然后对她们进行想象训练。想象自己漫步在海滩上，初升的太阳照在脸上，海水轻柔地漫过脚面等等。然后想象免疫细胞如何杀死癌细胞，被杀死的癌细胞又是如何被海水冲刷掉。在干预的前后，分别采取病人的唾液和血液，测定NK细胞的活性。结果发现心理―行为干预可以显著提高NK细胞活性。而且需通过服药来克服放疗引起的白细胞计数降低的副作用的患者比例显著下降[24]。该研究表明，心理行为干预对免疫功能的改善和恢复具有非常显著的作用。

第二个研究纳入120名正在接受放化疗的癌症患者。同样的，依据匹配原则他们被分为一个干预组和一个控制组。除了干预的时间延长到3个月以外，其他的实验条件与上述研究基本相同。所测定的指标包括白细胞计数、NK细胞活性和免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA)等。结果发现，干预组在所有免疫功能参数上都得到了不同程度的提高，其中NK细胞活性显著提高[25]，生活质量也都得到明显的改善，治疗引起的副作用在很大程度上也得到了缓解。不论是乳腺癌还是肺癌患者，不论是放疗患者还是化疗患者，干预组的生活质量评分，包括躯体功能、角色功能、情绪功能、认知功能和社会功能上都显著高于控制组。同时干预组的症状评分，包括疲劳、呕吐、疼痛和食欲不振等都有显著下降[26~28]。而且，通过行为干预，患者学会运用更为积极的认知方式来应对癌症，摒弃原先的逃避心理，从而使得情绪状态、身体机能和生活质量都得到很好的改善[29,30]。成长策略和社会支持有助于提高癌症生存者的生活质量，增加正性情感[31]。这些结果反复证明了，NK细胞的活性对认知行为干预的作用相当敏感，心理行为干预确实改善了癌症患者及其生存者的生活质量。免疫功能的提高， 特别是NK细胞活性的增强可能在心理行为干预中起着重要的中介作用。

4结语

中枢神经系统和免疫系统之间存在着相互作用。上述三个方面的工作证明某些心理过程，比如联想性学习、情绪、行为想象、和认知策略等确实可以对免疫功能产生影响。也即高级神经精神活动能调节免疫功能。但免疫系统的变化也能影响高级神经精神活动的功能。免疫系统的紊乱不仅导致疾病，也与衰老、性格和行为变化有关。如抑郁症或“病态行为”就与细胞因子如白细胞介素-1有关[32,33]。但这方面的研究尚需深入展开。随着中枢神经系统和免疫系统之间相互作用研究的深入，在人类健康的维护和疾病的防治上将会有新的前景。

致谢：作者感谢曾对本文的研究工作做出重要贡献的博士后、博士生、硕士生和研究助手，他们是王建平、李杰、邵枫、黄景新、陈极寰、王玮雯、刘艳、郑丽、李波、吕倩、卫星、郭友军。

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影响因子： ： 32377375 期刊年卷：Cell Discov 2020;6 生物二区 细胞生物学 Q2 60/190 DOI：

使用单细胞测序，作者分析了血液中免疫种群的复杂性，并分析了10位患者的70,858个细胞。作者确定了ERS患者的高炎症反应，这可以解释为什么某些患者出院后生病，并建议应重新评估当前的出院标准。此外，作者鉴定了髓样，NK，T和B细胞的独特标志，并指出了TCR和BCR表位的变化。作者的发现有助于阐明抗病毒免疫机制，并揭示了使用疫苗和中和抗体开发免疫疗法的有希望的机会。

用于了解SARS-COV-2清除后的免疫细胞组成（来自PBMC）

回顾性了解免疫细胞反应并告知可能的疫苗设计/药物靶标

用于识别康复患者的免疫特征

作者将患者区分为早期康复阶段（n = 5，ERS，自从对COVID19呈阴性以来<7天）和晚期康复阶段（n = 5，LRS，> 14天），并将这些患者与健康对照组进行比较（n = 5）

PBMC的单细胞RNA测序

scBCR-seq和scTCR-seq评估扩增的B细胞和T细胞克隆的克隆性

计算方法没有得到很好的描述，因此某些数字并未直接突出显示得出的结论

使用的某些工具不是标准的工作流程工具，因此需要在方法中进行进一步说明

优点：

缺点：

由SARS-CoV-2引起的COVID-19最近影响了1,200,000多人，造成60,000多人丧生。关键的免疫细胞亚群发生变化，其在COVID-19过程中的状态仍不清楚。作者试图通过单细胞RNA测序技术全面表征COVID-19恢复期外周血单个核细胞的转录变化。发现在COVID-19的早期恢复期（ERS）中，患者的T细胞显著减少，而单核细胞增加。具有较高炎症基因表达的经典CD14 ++单核细胞比例增加，并且ERS中CD14 ++ IL1β +单核细胞的丰度更高。CD4 + T细胞和CD8 + T细胞显著减少，并在ERS中表达高水平的炎症基因。在B细胞中，浆细胞显著增加，而幼稚B细胞减少。确定了几个新的B细胞受体（BCR）的变化，例如IGHV3-23和IGHV3-7，并确认了以前用于病毒疫苗开发的同种型（IGHV3-15，IGHV3-30和IGKV3-11）。最强的配对频率IGHV3-23-IGHJ4表示与SARS-CoV-2特异性相关的单克隆状态，尚未有报道。此外，综合分析预测，IL-1β和M-CSF可能是炎性风暴的新型候选靶基因，而TNFSF13，IL-18，IL-2和IL-4可能对COVID-19患者的康复有益。作者的研究提供了ERS中炎症性免疫信号的第一个证据，提示出院后COVID-19患者仍然易受伤害。新的BCR信号转导的鉴定可能导致开发用于治疗COVID-19的疫苗和抗体。

为了绘制COVID-19患者的免疫微环境图，作者鉴定了血液中的镜像变化，并查明了与疾病严重程度和恢复相关的细胞特异性变化。然后，作者从 早期恢复阶段（ERS）或晚期恢复阶段（LRS）（70,858 PBMC）的总共10例COVID-19患者中整合了scRNA-seq，单细胞配对BCR和单细胞配对TCR分析。作者还从五个健康供体作为对照收集了scRNA-seq数据（57,238个细胞）（图 1a ** 和补充图 S1a–c ）。**该数据集通过了严格的高质量过滤。使用10x Genomics将scRNA-seq样品的单细胞悬液转化为条形码的scRNA-seq库。Cell Ranger软件（版本）用于测序数据的初始处理。

图1：COVID-19患者单免疫细胞谱分析的研究设计和分析

作者使用t分布随机邻居嵌入（t-SNE），根据典型谱系标记物和在每个簇中上调的其他基因的表达，分析了三种免疫细胞谱系，髓样，NK，T和B细胞的分布（图 1b，c ）。对于标记基因，位于t-SNE中的每个细胞中的表达值如图 1d 所示。接下来，作者分别将每个谱系的细胞聚类，并鉴定出总共20个免疫细胞簇。

从COVID-19感染中恢复过来的患者的免疫细胞区包括所有主要的免疫谱系。作者分析了通过质量控制的128,096个scRNA-seq概况，包括来自五个HC，五个ERS和五个LRS患者的36,442个髓样细胞，64,247个NK和T细胞以及10,177个B细胞。补充图 S2a中 显示了每个主题的粗略聚类分析景观，图 2a中 显示了每个组的合并图像。作者发现，与HCs相比，包括ERS和LRS在内的COVID-19患者的髓样细胞比例更高，但NK和T细胞比例更低（图 2b，c ）。有趣的是，与ERS患者相比，LRS患者的B细胞，NK和T细胞更多，但髓样细胞却更少（图 2b，c ）。因此，这些发现表明COVID-19患者外周血中淋巴细胞计数降低，而髓样细胞计数升高。

为了进一步了解COVID-19恢复早期和晚期患者中单核细胞的变化，作者进行了基因表达分析，并使用统一流形近似和投影（UMAP）将髓样细胞亚群化为六个转录不同的亚群。

经典CD14 ++单核细胞（M1）， 非经典CD16 ++（FCGR3A）CD14- / +单核细胞（M2）， 中间CD14 ++CD16 +单核细胞（M3）， CD1C + cDC2（M4）， CLEC9A + cDC1（M5 ）和 pDC（CLEC4C +CD123 +）（M6）

存在于六个不同的簇中（图 3a，b ）。作者发现在HCs和COVID-19患者之间，单核细胞亚群的区室显著不同（图 3c ）。在髓样细胞中，ERS患者中经典CD14 ++单核细胞（M1）的比例高于HCs，而LRS患者中则几乎是正常的（图 3c ）。

图3：恢复期COVID-19患者血液中的髓样细胞亚群及其状态

作者发现，COVID-19患者的CD14 ++ IL1β +单核细胞和IFN激活的单核细胞比HCs富集（图 3d–f ）。与CD14 ++炎性单核细胞（M1）相关的基因具有高表达水平的炎性基因，例如 IL1β，JUN，FOS，JUNB 和 KLF6 。趋化因子 CCL4，CXCR4 ; 以及干扰素刺激的基因 IFRD1，IRF1 和 IFI6 。相比之下，与HCs中的CD14 ++单核细胞（M1）相关的抗炎基因在COVID-19患者中被下调（图 3d，e ）。值得注意的是，UMAP中的IL1β表达值同时具有对比，表明ERS组中IL1β上调，而LRS患者中IL1β下降（图 3f ）。与HCs相比，ERS组的DC集群中也证实了这一点（补充图 S3a，b ）。接下来，作者获取了COVID-19患者与HCs中每个髓样细胞scRNA-seq亚型的平均炎症基因（补充图 S3c ）。这些结果表明，细胞因子的激活驱动单核细胞群的扩展（尤其是CD14 ++感染COVID-19的患者中的炎性单核细胞）。为了探索M1簇中转录变化的生物学意义，作者用DEG进行了GO分析（图 3g ）。作者观察到与细胞因子信号传导和炎症激活相关的途径的富集，这是由 IFITM3 和 IFI6 和 IL1β，JUN，FOS，JUNB 和 KLF6 的上调驱动的（图 3g ）。

T细胞和NK细胞在呼吸道感染中发挥病毒清除关键作用 15 ， 16 。作者的聚类分析基于规范标记（图 4b 和补充图 S4a ）将T和NK淋巴细胞分为10个子集（图 4a ）。

NK细胞高表达NCAM1，KLRF1，KLRC1和KLRD1 ;

（1）NK细胞细分为CD56 + CD16 - NK细胞（NK1），它们表达高水平的 CD56 和低水平的 CD16 ；

（2）C56 - CD16 + NK细胞（NK2），它们表达高水平的 CD16 和低水平的 CD56 。

CD4 + T细胞表达CD3E和CD4 ; 然后将这些细胞细分为四个簇：

（1）幼稚的CD4 + T细胞（T1），它们表达高水平的 CCR7，LEF1 和 TCF7 ；

（2）中央记忆CD4 + T细胞（T2，CD4 Tcm），表达高水平的 CCR7 ，但与单纯CD4 + T细胞相比， AQP3 和 CD69 更高；

（3）效应器记忆CD4 + T细胞（T3，CD4 Tem），表达高水平的 CCR6，CXCR6，CCL5 和 PRDM1 ;

（4）调节性T细胞（T4，Treg），表达 FOXP3 。

CD8 + T细胞表达CD8A和CD8B，并细分为三个簇：

（1）幼稚CD8 + T细胞（T5），其表达高水平的 CCR7，LEF1 和 TCF7 ，与幼稚CD4 + T细胞相似；

（2）效应记忆CD8 + T细胞（T6，CD8 Tm），表达高水平的 GZMK ；

和细胞毒性CD8 +淋巴细胞（CD8 +CTL）（T7），它们表达高水平的 GZMB，GNLY 和 PRF1 。

（3）增殖性T细胞（T8，T prol）是TYMS + MKI67 +细胞。

图4：恢复的COVID-19患者血液中T和NK细胞反应的特征。

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在HCs和COVID-19患者之间，T细胞和NK细胞亚群的组成存在显著差异（图 4c ）。在COVID-19患者中，CD8 + T细胞的绝对数量，特别是效应记忆CD8 + T细胞亚组和NK细胞的绝对数量减少，而ERS中NK细胞的相对比例高于HCs。CD4 + T细胞的比例是稳定的，但HCs和COVID-19患者之间CD4 + T细胞亚群的组成存在显著差异。在CD4 + T细胞中，中央记忆CD4 + T细胞的比例明显更高，而幼稚CD4 + T细胞，Tregs和效应记忆CD4的比例+  T细胞低于HCs，尤其是ERS组。值得注意的是，与CD4 + T细胞相关的基因具有较高的炎症相关基因表达水平，并且在COVID-19患者中明显上调（图 4d ）。CD4 + T细胞在COVID-19的ERS患者中具有高表达水平的炎症基因，包括 FOS，JUN，KLF6 和 S100A8 （图 4e ）。相反，COVID-19患者的CD4 + T细胞相关的抗炎基因相对于HCs被下调（图 4d，e ）。这表明CD4 +T细胞是病毒感染的主要参与者。CD4 + T细胞中DEG的比较揭示了参与细胞因子途径和炎症激活的基因的丰富，包括 IFITM3 和 IFI6 以及 IL1B，JUN，FOS，JUNB 和 KLF6 （图 4f ）。需要进一步的研究阐明与COVID-19发病机制有关的IFN途径。

TCR-seq分析显示，ERS组的T细胞扩增明显低于HC组（图 4g ）。此外，幼稚或中枢记忆T细胞几乎没有克隆扩增，而效应记忆T细胞，末端效应CD8 + T细胞（CTL）和增殖T细胞则显示出更高的扩增水平（图 4h ）。另外，ERS组中扩增最高（最大）的克隆是TRAV8-6-TRAJ45：TRAV7-8-TRBJ2-1（补充图 S5d ）。COVID-19患者中CD8 + T细胞比例的降低可能暗示了CD8 + T细胞在病毒清除中的作用（图 4c ）。而且，CD8 +与HCs中的克隆相比，具有扩展克隆的CTL还表现出过度活化的炎症和抗病毒活性（图 4i 和补充图 S4b ）。总之，这些发现表明COVID-19患者外周血中CD8 + T细胞的克隆扩增有助于控制该病毒。作者还通过Seurat FindAllMarkers 分析进行了DEG分析，并在T prol细胞中发现了相似的结果（补充图 S4c ）。接下来，作者将COVID-19患者中每个NK和T细胞亚群scRNA-seq子集的炎症基因与正常RNA-seq数据的 平均值进行比较 （补充图 S4d ）。

通过使用扩散图预测B细胞的基因表达数据，作者使用

scRNA-seq鉴定了四个B细胞簇：

表达 CD19，CD20（MS4A1），IGHD，IGHM，IL4R和 TCL1A的 幼稚B细胞（B1）；**

表达 CD27，CD38和 IGHG的 记忆B细胞（B2）; **

仅表达 CD19和 CD20（MS4A1）的 未成熟B细胞（B3 ） ；**

以及表达高水平 XBP1和 MZB1的 浆细胞（B4）（图 5a，b 和补充图 S5a ）**。

图5：在COVID-19患者中单细胞B细胞的表征。

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与HCs相比，COVID-19患者的浆细胞百分比显著增加，而COVID-19患者的幼稚B细胞百分比显著降低（图 5c ）。记忆B细胞和浆细胞（MPB）可能在病毒感染的控制和过继免疫的发展中起重要作用，因为它们协同工作并诱导特异性抗体。此外，与 HCs相比 ，包括 S100A8，IGLL5，SSR3，IGHA1，XBP1 和 MZB1 在内的B细胞活化相关基因主要在ERS组的MPB中表达（图 5d ）。作者还在浆细胞，抗体分泌细胞（ASC）中发现了类似的结果（补充图 S5b，c ），提示ASC在病毒控制中起关键作用。接下来，作者将COVID-19患者每个B细胞亚群的炎症基因平均值与正常RNA-seq数据进行比较（图 5e ）。ERS和HCs之间的基因差异表明COVID-19患者的B细胞反应和抗体分泌增强。GO分析表明， MPHA中IGHA1，XBP1，MZB1，JUN，POLR2L 和 ZFP36 的表达过高，这表明COVID-19患者的B细胞增殖和病毒转录增强（图 5f ）。单细胞BCR-seq分析表明，与HC中相比，COVID-19患者中IgA同种型的表达过高（图 5g） ）。这与血清IgA水平升高相对应，这在其他冠状病毒感染中也很明显。此外，在ERS患者中，（IgA + IgG + IgE）与（IgD + IgM）的比例显著增加，并且随着恢复时间而呈下降趋势（图 5h ）。

使用sc-BCR-seq评估患者血液中克隆扩增的状态，作者发现IL4R +幼稚B细胞显示出很少的克隆扩增，而CD27 + CD38 +记忆B细胞显示出在各种B细胞亚群中最高的扩增水平（图 6a ）。在个体水平上，作者发现与HCs相比，COVID-19患者的克隆明显扩增，这支持了B细胞在SARS-CoV-2感染下经历了独特的VDJ克隆重排的假设。作者还发现，与LRS患者相比，ERS中始终保持较高的B细胞克隆性（图 6b）。 ）。此外，对每个受试者的最大扩增（最大）克隆的定量显示，ERS组中最大克隆的比率高于HCs中的最大克隆的比率（图 6c ）。为了了解扩增的克隆B细胞的功能状态，作者在克隆的记忆B细胞和其他B细胞之间进行了DEG分析。作者的结果表明B细胞基因的表达增加，包括 CD27，SSR4，IGHG1，MZB1 和 XBP1 ，这进一步支持了扩增的克隆B细胞的优异效应子功能（图 6d ）。而且，随着时间的流逝，扩增的B细胞的差异基因会明显消退，而在LRS患者中会降低（图 6d ）。

图6：在COVID-19患者中观察到BCR克隆扩增，VDJ基因使用偏倚。

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为了研究COVID-19患者中BCR的独特变化和偏好基因，作者比较了COVID-19患者和HCs中VDJ基因的使用情况。作者确定了IGHV3家族的过度表达，COVID-19患者相比尤其是在IGHV3-7，IGHV3-15，IGHV3-21，IGHV3-23和IGHV3-30 （图 6E ）。优选的IGKV是IGKV1-17，IGKV2-28和IGKV3-15，而优选的IGLV是IGLV1-44，IGLV2-8和IGLV3-27（图 6e ）。此外，ERS患者的前两个配对频率是IGHV3-23-IGHJ4和IGHV3-7-IGHJ6（图 6f） ）。这些细胞显示出IGH亚基与分别由IGLV1-44-IGLJ3和IGKV1-17-IGKJ1编码的IGK / L亚基配对，这表明与SARS-CoV-2特异性相关的扩展状态。单独地，ERS-4和ERS-5具有最大的克隆，分别参考IGHV3-23-IGHJ4（补充图 S5e ）和IGHV3-7-IGHJ6（补充图 S5f ）。

总之，以IgA和IgM同种型为主的COVID-19克隆性的增加，以及IGHV基因的偏斜使用，提示SARS-CoV-2对发病机理的贡献。值得注意的是，COVID-19患者中主要IGV基因（尤其是IGHV3-23和IGHV3-7）的偏好为合理设计SARS-CoV-2疫苗提供了框架。

用于预测可能有助于ERS和LRS中T细胞，B细胞，单核细胞和树突状细胞（DC）不同功能状态的细胞间相互作用（图 7a，b ）。在ERS COVID-19患者中，作者发现了与单核细胞激活，增殖和炎症信号有关的适应性信号（图 7a，b ）。

T细胞表达的基因编码TNFSF8，LTA，IFNG，IL17A，CCR5和LTB的配体与TNFRSF8，TNFRSF1A / TNFRSF14，IFNGR1，IL-17RA，CCR1和LTBR的配体相关，这些基因在单核细胞上表达，可能有助于促炎状态。其他T细胞-单核细胞相互作用涉及CSF2和CSF1的表达。

T细胞可能通过CSF2和CSF1的表达激活单核细胞，而CSF2和CSF1与CSFR（CSFR2 / 1）结合并促成炎性风暴。CD14 +单核细胞簇仅表达IL1β，据预测它将与T细胞表达的IL1RAP结合。T细胞与单核细胞的相互作用可能会增强免疫应答，并且仅针对COVID-19患者（图 7a，b ）。

此外，作者发现单核细胞高表达脊髓灰质炎病毒受体，在脊髓灰质炎病毒复制和诱导NF-κB信号传导的第一步中，它作为脊髓灰质炎病毒的细胞受体。从B细胞单核细胞和B细胞T细胞的相互作用中，作者发现B细胞可以分泌大量IL-6，LTA和LTB，并与在单核细胞中表达的IL-6R，LTAR和LTBR结合，大量的IL-6应用于T细胞，以促进IFN-γ，IL-1β和其他炎症细胞因子和趋化因子的分泌。因此，在ERS COVID-19患者的发病高峰中形成了高表达IL-6及其后代的炎性单核细胞的级联特征（图 7c ）。这些活化的免疫细胞可能大量进入肺和其他器官的循环，并发挥免疫破坏作用。

在LRS COVID-19患者中，预计DC配体会与参与细胞增殖和抗体产生的B和T细胞受体相互作用。作者发现LRS患者的外周血含有多种抗体。作者发现，在作者对DC-B细胞相互作用的分析中，IL18-IL18RAP，TNFSF13-TNFRSF13B，TNFSF13-TNFRSF17，TNFSF13B-TNFRSF17，TNFSF13B-TNFRSF13B和TNFSF13B-TNFRSF13C高度表达（图 7d ）。因此，作者推测DC产生IL-18，TNFSF13和TNFSF13B来促进B细胞的增殖，然后在ERS的血液中分泌许多抗体。

从DC-T和T细胞-B细胞的相互作用中，作者发现DC不仅产生IL-18，而且产生IL-7以促进T细胞的增殖。此外，T细胞产生IL-2以促进B细胞的增殖和抗体产生（图 7d ）。因此，细胞间的相互作用有助于作者理解为什么COVID-19患者表现出高单核细胞率和低淋巴细胞率，以及为何康复患者外周血中淋巴细胞的比例逐渐增加。

图7：在COVID-19患者中免疫细胞之间的细胞间通讯。

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使用单细胞测序，作者分析了血液中免疫种群的复杂性，并分析了10位患者的70,858个细胞。作者确定了ERS患者的高炎症反应，这可以解释为什么某些患者出院后生病，并建议应重新评估当前的出院标准。此外，作者鉴定了髓样，NK，T和B细胞的独特标志，并指出了TCR和BCR表位的变化。作者的发现有助于阐明抗病毒免疫机制，并揭示了使用疫苗和中和抗体开发免疫疗法的有希望的机会。

国家通常会对某些具有较高传染性、危害较大且可预防的疾病实行强制免疫，这些疾病包括但不限于麻疹、流行性腮腺炎、白喉等。强制免疫的目的是为了控制这些疾病的传播、减少疾病的发病率和死亡率，从而保障公共卫生安全。另外，针对这些疾病建立免疫档案可以记录个人的免疫状态和接种情况，为后续的免疫接种提供参考，并且方便医务人员在需要时及时提供相应的医疗服务和紧急救治。